一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂

【技术实现步骤摘要】
一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法
本专利技术属于分子生物学检测启动子活性
，具体的说涉及一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法。
技术介绍
蜜蜂是重要的经济昆虫，也是典型的社会性昆虫。在正常的蜂群中，通常有一只蜂王，数百至上千只雄蜂（有季节性出现）和数千至数万只工蜂。蜂王和工蜂都是雌性蜂，由遗传物质完全相同的受精卵发育而来，但是二者在生理、行为方面差异很大。蜂王和工蜂的级型分化是一种典型的表观遗传现象。表观遗传是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。表观遗传和非编码RNA调控、DNA甲基化和组蛋白乙酰化等相关。其中DNA甲基化是一种很广泛的表观遗传学调节机制，它是指在DNA甲基化转移酶（DNAmethyltransferases，Dnmts）的作用下，将甲基添加在DNA分子中的碱基上，从而影响基因的表达。西方蜜蜂体内拥有一套完整的DNA甲基化系统，拥有3种5-甲基胞嘧啶DNA转移酶，分别是Dnmt1、Dnmt2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂

【技术特征摘要】
1.一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，包括以下步骤：
（1）载体构建
（1.1）从NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载预测的西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1和西方蜜蜂基因组序列，利用Bioedit软件从西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1中找出西方蜜蜂Dnmt3基因编码区序列；
将西方蜜蜂Dnmt3基因编码区序列与西方蜜蜂基因组序列进行比对，确定西方蜜蜂Dnmt3基因翻译起始密码子“ATG”在西方蜜蜂基因组序列上的具体位置；
再在西方蜜蜂基因组序列上选取西方蜜蜂Dnmt3基因翻译起始密码子“ATG”之前2256bp的片段作为启动子区域片段，并进一步将启动子区域片段依次截短成950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段；
将上述启动子片段用EcoRI、NotI进行双酶切，酶切后启动子片段的两端带有EcoRI和NotI酶切位点；
（1.2）制备酶切后的双荧光素酶报告基因检测载体质粒，
将双荧光素酶报告基因检测载体质粒用EcoRI、NotI进行双酶切，酶切后双荧光素酶报告基因检测载体质粒的两端带有EcoRI和NotI酶切位点；
（1.3）将步骤（1.1）获得的酶切后启动子片段与步骤（1.2）获得的酶切后双荧光素酶报告基因检测载体质粒进行连接；
（1.4）筛选重组子，其步骤包括，
（1.4.1）取连接产物直接转化JM109感受态细胞，向转化后的JM109感受态细胞中加入1ml的LB培养基，随后置于恒温摇床中于37°C下200转/分钟摇菌1小时；
然后取200µl转化后的JM109感受态细胞涂在含有氨苄青霉素的培养平板上，将平板置于恒温培养箱中于37°C过夜培养；
（1.4.2）从培养平板上随机挑取菌落于5ml的LB培养基中，37°C下250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，取阳性克隆菌液测序；
（1.4.3）经过测序验证后，使用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆重组子，以备转染；
（1.5）依次取2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段进行步骤（1.3）-步骤（1.4）操作，获得2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子；
（2）细胞转染
用于转染的细胞系所使用DNA与lip2000的比值为1µg：2～3µl；
（2.1）转染前24小时，将用于转染的细胞系接种至每孔含有500µl不含抗生素的培养基的24孔细胞培养板中，在转染时用于转染的细胞系可长至90-95%融合；
（2.2）转染液制备，每孔细胞用量如下：
（2.2.1）用50µl的Opti-MEI低血清培养基稀释所述步骤（1.5）获得的阳性克隆重组子，轻轻混匀；
（2.2.2）轻轻摇匀lip2000，之后分别取3µl的lip2000在50µl的Opti-MEI培养基中稀释，室温孵育5分钟；
（2.2.3）将前两步所稀释的阳性克隆重组子和lip2000轻轻混匀，室温放置20分钟，获得转染液；
（2.3）在步骤（2.1）所述24孔细胞培养板的每孔细胞中加入100µl步骤（2.2）制备的转染液，轻轻摇匀，进行细胞转染；
（2.4）孵箱中37°C下培养18-48小时后检测基因表达，获得转染后细胞系；
（2.5）依次取2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子进行步骤（2.2）-步骤（2.4）操作，获得2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子转染的转染后细胞系；
（3）双荧光素酶检测
（3.1）试剂准备
按照双荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：王子龙，李茫，张丽珍，曾志将，吴小波，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西;36