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一种特异性检测病变胶原蛋白的探针、制备方法及应用技术

技术编号:24593166 阅读:39 留言:0更新日期:2020-06-21 03:02
本发明专利技术属于胶原蛋白检测技术领域,具体涉及一种特异性检测组织中病变胶原蛋白的多肽探针、制备方法及应用。本发明专利技术公开的多肽荧光探针包含多肽序列(Gly‑Hyp‑Pro)

A probe, preparation and application for specific detection of pathological collagen

【技术实现步骤摘要】
一种特异性检测病变胶原蛋白的探针、制备方法及应用
本专利技术属于胶原蛋白检测
,具体涉及一种特异性检测组织中病变胶原蛋白的多肽探针、制备方法及应用。
技术介绍
胶原蛋白作为哺乳动物体内含量最多的蛋白质,是细胞外基质的主要组成成分,在组织形成和维持体内平衡中发挥关键作用。研究表明,当胶原蛋白的产生和降解平衡遭到破坏时,会引发骨质疏松、肌肉骨骼组织损伤等诸多疾病。研究还发现,人体的正常发育和组织修复中存在胶原重塑的过程,即天然胶原的三螺旋结构在蛋白水解酶或其他外力的作用下会发生形变或降解。若在胶原重塑过程中,胶原产生过多,则过量的胶原会在器官中累积,容易产生组织纤维化,最终导致肿瘤等严重疾病;若胶原发生不可控的降解,则会导致胶原蛋白退化性疾病,如关节炎等。因此,如何快速准确的检测机体组织中的病变胶原蛋白的含量,对于预防和早期治疗与胶原蛋白病变相关疾病具有重要意义。目前,对于机体组织中的病变胶原蛋白含量的检测主要通过抗体抗原免疫法或传统染料为核心的试剂盒来检测,但是抗体抗原免疫试剂盒的检测过程复杂,特异性和稳定性较差;传统染料的检测能力又十分有限。同时,以上方法都不能有效的检测组织中的病变胶原蛋白。随着探针技术的研究不断进展,已发现一些可作为识别胶原蛋白的短肽探针,并用于体外胶原蛋白的识别及成像,包括天然氨基酸多肽序列和非天然氨基酸多肽,但是,这些多肽存在稳定性差、组织成像时的特异性弱,且难以区分病变胶原蛋白等缺点。同时,非天然氨基酸多肽的合成成本较高,并且应用于体内检测会存在安全隐患。因而,具有(Gly-X-Y)n重复氨基酸序列的天然氨基酸多肽是目前用于制备病变胶原检测探针的常用元件,主要包括GOO(Gly-Hyp-Hyp)、GPO(Gly-Pro-Hyp)和GPP(Gly-Pro-Pro)。但是,以天然氨基酸多肽序列为元件制备的检测探针自身容易形成三重螺旋结构,丧失对病变胶原蛋白的结合能力;而且这些探针单链稳定性差,在使用前一般需要高温等物理条件处理,使其保持单链状态。而高温等前处理过程容易导致待检测组织出现不必要的损伤,影响检测结果的准确性。因此,为了使天然氨基酸多肽序列能够保持更好的单链状态,现有技术中一般采用其他氨基酸对天然氨基酸多肽序列的两端进一步修饰的方法,但是这种修饰过程比较复杂。例如,中国专利CN110129029A公开了一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针,通过在GPO、GPP或GOO元件的序列一端连有带电荷的氨基酸,另一端修饰发光物质获得。其中多肽序列GPO、GPP或GOO本身合成难度较大,向序列中引入数个带电荷的氨基酸会进一步导致合成过程的复杂化,增加探针的合成成本。再例如,中国专利CN107530454A公开了一种肽缀合物,所述缀合物是将两条胶原杂肽通过接头连接形成的二聚胶原杂肽,但是所述的肽缀合物结构复杂,制备过程中容易错配导致获得的肽缀合物结构差异较大,影响检测结果。针对现有技术存在的问题,专利技术人经过多次试验研究,发现,含有多个GOP(Gly-Hyp-Pro)重复序列的多肽在不经过引入其他组分的前提下,即具有显著的单链稳定性,在该多肽序列的N端连有信号分子后,可作为多肽探针用于胶原蛋白的检测;该多肽探针制备简易,与现有的多肽(GPO、GPP或GOO)探针相比,具有良好的单链稳定性,使用前不需要经过加热等预处理步骤,完全避免了探针预处理可能对待测样品造成的损伤,最大程度地保证了该探针的检测效果。并且该多肽探针能够特异性的结合病变胶原蛋白,可用于体外检测病变胶原蛋白的含量,在关节炎,纤维化等胶原蛋白相关疾病的早期检测与疗效评估等领域具有广阔的应用前景。
技术实现思路
针对上述技术问题,本专利技术的目的在于提供一种检测病变胶原蛋白的多肽探针,所述多肽探针包括多肽序列(Gly-Hyp-Pro)n和修饰在所述多肽序列(Gly-Hyp-Pro)nN端的信号分子X,其中n为大于6的整数。优选地,所述信号分子X为荧光素类染料、香豆素类染料、罗丹明类染料、菁类染料、BODIPY类染料、四苯基乙烯类染料,六苯基甲硅烷类染料、二苯乙烯蒽类染料、半导体量子点、碳量子点、钙钛矿量子点、稀土离子配合物、金属框架材料、上转化稀土纳米材料和长余辉纳米材料中的一种或几种。优选地,所述信号分子X为羧基荧光素FAM。优选地,所述信号分子X和所述多肽序列(Gly-Hyp-Pro)n之间通过接头Ahx连接,所述多肽探针的序列为FAM-Ahx-(Gly-Hyp-Pro)n。优选地,所述n为8到12之间的任何整数。本专利技术的另一目的在于提供一种多肽探针的制备方法,所述方法包括:(1)固相合成多肽树脂(Gly-Hyp-Pro)n;(2)将4eq的信号分子、HOBt和HBTU溶解于DMF中,低温活化10-30min后,向溶液中滴加4-10eq的DIEA,得混合液;(3)将步骤(2)制备的混合液加入到步骤(1)所述的树脂中,避光反应12-48h;(4)将步骤(3)反应后的树脂用切割液处理2-4h后,加入冰乙醚,所得沉淀即为多肽探针,其中所述切割液由体积比为95:2.5:2.5的三氟乙酸、自由基捕获剂和水组成。本专利技术的另一目的在于提供一种多肽探针在制备检测病变胶原蛋白含量的检测试剂,和/或试剂盒,和/或成像试剂中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种包含上述多肽探针的检测试剂。本专利技术的另一目的在于提供一种包含上述多肽探针的检测试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种包含上述多肽探针的组织成像试剂。本专利技术的有益效果是:①本专利技术提供的多肽探针制备简易;②本专利技术提供的多肽探针具有良好的单链稳定性;③本专利技术提供的多肽探针可特异性的结合病变胶原蛋白,结合能力强,可用于体外检测病变胶原蛋白的含量;④本专利技术提供的多肽探针具有良好的荧光发光性能,可作为组织成像试剂,广泛用于胶原蛋白相关疾病的早期诊断,具有广阔的应用前景。附图说明图1多肽探针的荧光染色性能检测图;图2多肽探针溶液比色对比图;图3多肽探针溶液的荧光强度对比图;图4多肽探针的热稳定性曲线对比图;图5多肽探针对小鼠肠组织染色荧光显微镜图;图6多肽探针对小鼠尾组织染色荧光显微镜图;图7多肽探针对人骨关节炎纤维软骨病理切片染色荧光显微镜图;图8多肽探针对人骨关节炎透明软骨病理切片染色荧光显微镜图。具体实施方式以下具体结合实施例进一步描述本专利技术的技术方案,但本专利技术的保护范围不局限于以下所述。以下实施例中制备的多肽探针GOP-8、GOP-10和GOP-12可特异性的结合病变胶原蛋白,并具体以GOP-10为例进行了组织荧光染色,但是本专利技术所述的多肽探针并不局限于GOP-10,其他探针也具有良好的荧光染色能力,且能够特异性结合病变胶原蛋白。实施例1多肽探针GOP-4的制备1.多肽探针的设计本实施例设计的多肽探针序列为:FAM-Ahx-(GOP)4-NH2,其中FAM为羧基本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种检测病变胶原蛋白的多肽探针,其特征在于,所述多肽探针包括多肽序列(Gly-Hyp-Pro)

【技术特征摘要】
1.一种检测病变胶原蛋白的多肽探针,其特征在于,所述多肽探针包括多肽序列(Gly-Hyp-Pro)n和修饰在所述多肽序列(Gly-Hyp-Pro)nN端的信号分子X,其中n为大于6的整数。


2.如权利要求1所述多肽探针,其特征在于,所述信号分子X为荧光素类染料、香豆素类染料、罗丹明类染料、菁类染料、BODIPY类染料、四苯基乙烯类染料,六苯基甲硅烷类染料、二苯乙烯蒽类染料、半导体量子点、碳量子点、钙钛矿量子点、稀土离子配合物、金属框架材料、上转化稀土纳米材料和长余辉纳米材料中的一种或几种。


3.如权利要求2所述的多肽探针,其特征在于,所述信号分子X为羧基荧光素FAM。


4.如权利要求1所述的多肽探针,其特征在于,所述信号分子X和所述多肽序列(Gly-Hyp-Pro)n之间通过接头Ahx连接,所述多肽探针的序列FAM-Ahx-(Gly-Hyp-Pro)n。


5.如权利要求4所述的多肽探针,其特征在于,所述n为8到12之间的任何整数。

【专利技术属性】
技术研发人员:肖建喜蔡向东
申请(专利权)人:兰州大学
类型:发明
国别省市:甘肃;62

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