一种续断药材加工及含量测定方法、化合物及确认方法技术

本发明专利技术涉及一种续断药材加工及含量测定方法、化合物及确认方法，该加工方法通过烘干、发汗等方法加工而成，建立了通过HPLC法同时测定续断药材中8种化合物含量的方法，并利用HPLC‑ESI‑MS法进一步确定各化合物结构的检测方法及明确化合物特征，提供了全面而精确的续断药材质量评价方法，为研究续断发汗加工方法的科学内涵提供了依据。

A processing and content determination method, compound and confirmation method of Dipsacus asperoides

【技术实现步骤摘要】
一种续断药材加工及含量测定方法、化合物及确认方法
本专利技术涉及医药专利
，具体涉及一种续断药材加工及含量测定方法、化合物及确认方法。
技术介绍
续断，中药名，又名和尚头，为川续断科多年生草本植物川续断DipsacuasperWall.exHenry的干燥根，因能“续折接骨”而得名，既补肝肾，壮筋骨，又能通能利血脉，流畅气血，消除瘀血肿痛，促进断伤筋骨的生长接续，故为伤科常用之要药。自1977年版至今，中国药典规定续断药材要“发汗”加工后使用。目前，中国药典主要采用HPLC测定续断药材中的一个化合物川续断皂苷VI，作为续断药材的质量评价指标。但中药具有多成分、多功效的特点，仅以单一成分还不能全面表达中药质量。岳媛等人用HPLC法建立了测定续断中马钱苷酸、马钱苷、当药苷和川续断皂苷VI的含量；冯良用RP-HPLC-ELSD建立了同时测定川续断皂苷X、川续断皂苷VI、川续断皂苷XIII、α-常春藤皂苷4个皂苷类成分；陈璞等用HPLC法检测续断中川续断皂苷VI、马钱苷、当药苷的含量。上述方法对评价续断药材的质量发挥了技术控制作用，但是由于续断药才的化学组分很多，仅测定其中一类成分的多个化合物还不能全面代表药材的多组份和多功效特点，关键是上述方法不能确认各化合物结构。现有技术“HPLC同时测定续断中7种成分的含量”，马蕙文；易红；李春；张东；田莲超中国实验方剂学杂志2017-12-2，建立HPLC同时测定续断中7种成分(当药苷,马钱苷,马钱苷酸,绿原酸,川续断皂苷Ⅵ,续断苷A和续断苷B)含量的方法，为全面评价和控制续断的质量提供科学依据。供试品溶液的制备精密称取续断药材粉末(80目，下同)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％乙醇25mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，称重量，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。色谱条件：采用HPLC测定，色谱条件为VenusilHILIC色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)梯度洗脱(0-20min，95％A；20-40min，95％-87％A；40-64min，87％-84％A；64-65min，84％-78％A；65-80min，78％-77％A)，流速1.0mL·min-1，柱温30℃，进样量10μL，检测波长235nm和212nm。现有技术“HPLC同时测定续断中7种成分的含量”存在以下缺陷：①在超声提取之前未经过浸泡，有效成分不能充分提取；②提取溶剂是75％乙醇，浓度较高造成提取溶剂的浪费；③梯度洗脱程序耗时长，造成检测分析成本增高；④未利用HPLC-ESI-MS技术对续断样品中7个化合物结构进行确认，不能全面而精确的对续断药材进行组分化合物评价。现有技术中，申请号：CN201710984069.6；专利技术名称：一种续断发汗炮制方法；包括如下步骤：1)将新鲜采挖的续断地下根进行冲洗除杂，使表面无泥沙后晾干至表面无水分；2)将晾干的续断置于60～80℃条件下干燥；3)将干燥后的续断经回润法使其含水量达到30～50％；4)将经回润后的续断在20～30℃条件下密闭堆置48～96h，至续断变柔软，续断的内外部变色；5)将发汗后的续断置于60～80℃条件下干燥24～48h，使其含水量为10％以内即可。该专利技术通过密闭堆置发汗使续断内部的水分外渗，有利于续断从内到外整体干燥，而不是外干内湿；经本专利技术续断发汗炮制方法处理后续断的有效化学成分(川续断皂苷Ⅵ)含量相较于现有未发汗的续断最高可提高17.5％。申请号CN201710984069.6，该专利技术存在以下缺陷：①发汗后的续断置于60～80℃条件下要干燥24～48h，方使其含水量达到10％左右，其采取的是堆制发汗，会引起续断各部位含水量不均匀，容易造成生霉、色泽不一致，续断质量不均一；②单纯使用烘干法，时间长容易导致有效成分挥发。现有技术中并未公开利用HPLC-ESI-MS法进一步确定8个化合物结构的方法。针对以上问题，以续断中分离获得的单体化合物为对照品，利用HPLC方法，考察提取溶剂、样品处理方法及提取时间，并考察该方法的专属性、线性关系、精密度、稳定性、重复性及加样回收试验，通过HPLC-ESI-MS法进行结构确认，得到各个色谱峰在负离子模式下([M-H]-)和在正离子模式下([M+H]+、[M+Na]+)的质谱信息，建立续断中多个化合物的含量测定方法。利用建立的方法检测发汗前、后的续断样品中8个化合物含量差异，经过续断系列代谢化合物数据库比对搜索，以含量的高低、产生或消失的化合物为指标，分析三萜皂苷类、环烯醚萜类等化合物的前体或转化后的结构类型，对差异化合物转化进行分析，以期全面评价续断药材质量的变化。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了建立一种续断药材加工方法；本专利技术的另一目的是建立HPLC同时测定续断药材中当药苷、马钱子苷、马钱苷酸、续断苷A、续断苷B、林生续断苷I、川续断皂苷VI和5-羟甲基-2-呋喃甲醛含量的检测方法；本专利技术另一目的是利用HPLC-ESI-MS法进一步确定各化合物结构及明确各化合物的确认方法。本专利技术所述一种续断药材加工方法具体为：续断采挖当天用水冲洗干净，净制除杂，50～70℃烘至含水量30～50％后，于20～30℃发汗3～7d，60℃烘干。优选的，所述一种续断药材加工方法具体为：续断于采挖当天用水冲洗干净，净制除杂，60℃烘至含水量40％后，于25℃发汗5d，60℃烘干。本专利技术所述的含量测定方法是利用HPLC法同时测定续断中8个化合物含量，包括以下步骤：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、色谱条件的设定、测定方法。本专利技术所述HPLC法同时测定续断中8个化合物含量的对照品溶液制备包括以下步骤：取各对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制成1.0520mg/mL川续断皂苷VI、1.0160mg/mL续断苷A、0.9700mg/mL续断苷B、1.2060mg/mL当药苷、1.1090mg/mL马钱甘酸、1.0800mg/mL林生续断苷I、1.0060mg/mL马钱子苷及1.0240mg/mL5-羟甲基-2-呋喃甲醛各对照品储备液；取各对照品储备液适量，精密量取，加甲醇稀释，制成0.1052mg/mL川续断皂苷VI、0.0508mg/mL续断苷A、0.0369mg/mL续断苷B、0.0603mg/mL当药苷、0.0554mg/mL马钱甘酸、0.0540mg/mL林生续断苷I、0.0503mg/mL马钱子苷及0.0512mg/mL5-羟甲基-2-呋喃甲醛的对照品混合溶液，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得检测用混合对照品溶液。本专利技术所述HPLC法同时测定续断中8个化合物含量供试品溶液的制备包括以下步骤：取续断样品细粉0.4～0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20～40％乙醇25mL，密塞，称定重量，浸泡20～40min后，在温度为35℃、功率为250本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种续断药材加工方法，其特征在于，采挖当天用水冲洗干净，净制除杂，50～70℃烘至含水量30～50％后，于20～30℃发汗3～7d，60℃烘干。/n

【技术特征摘要】
1.一种续断药材加工方法，其特征在于，采挖当天用水冲洗干净，净制除杂，50～70℃烘至含水量30～50％后，于20～30℃发汗3～7d，60℃烘干。


2.根据权利要求1所述的加工方法，其特征在于，采挖当天用水冲洗干净，净制除杂，60℃烘至含水量40％后，于25℃发汗5d，60℃烘干。


3.一种用于续断药材的含量测定方法，其特征在于，将权利要求1～2任一项所述续断药材加工方法加工而得的续断进行含量测定，所述含量测定方法是利用HPLC法同时测定续断中8个化合物含量，包括以下步骤：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、色谱条件的设定及测定方法。


4.根据权利要求3所述的含量测定方法，其特征在于，所述对照品溶液制备包括以下步骤：取各对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制成1.0520mg/mL川续断皂苷VI、1.0160mg/mL续断苷A、0.9700mg/mL续断苷B、1.2060mg/mL当药苷、1.1090mg/mL马钱甘酸、1.0800mg/mL林生续断苷I、1.0060mg/mL马钱子苷及1.0240mg/mL5-羟甲基-2-呋喃甲醛各对照品储备液；取各对照品储备液适量，精密量取，加甲醇稀释，制成0.1052mg/mL川续断皂苷VI、0.0508mg/mL续断苷A、0.0369mg/mL续断苷B、0.0603mg/mL当药苷、0.0554mg/mL马钱甘酸、0.0540mg/mL林生续断苷I、0.0503mg/mL马钱子苷及0.0512mg/mL5-羟甲基-2-呋喃甲醛的对照品混合溶液，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得检测用混合对照品溶液。


5.根据权利要求3所述的含量测定方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：取续断样品细粉0.4～0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20～40％乙醇25mL，密塞，称定重量，浸泡20～40min后，在温度为35℃、功率为250W、频率为40KHz的条件下超声处理20～40min，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置25mL容量瓶中，用提取溶剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。


6.根据权利要求5所述的含量测定方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：取续断样品细粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20％乙醇25mL，密塞，称定重量，浸泡30min后，在温度为35℃、功率为250W、频率为40KHz的条件下超声处理30min，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置25mL容量瓶中，用提取溶剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。


7.根据权利要求3所述的含量测定方法，其特征在于，所述色谱条件的设定及测定方法具体为：
色谱条件：以C18为色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸为流动相B进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～5min，10％A，90％B；5～12min，10％～13.3％A，90％～86.7％B；12～23min，13.3％A,86.7％B；23～45min，13.3％～37％A，86.7％～63％B；45～55min，37％A，63％B；55～65min，37％～10％A，63％～90％B；65～70min，10％A，90％B；柱温30℃；流速1.0mL/min；进样体积20μL；检测波长：川续断皂苷VI为212nm，续断苷A、续断苷B为230nm，当药苷、马前苷酸、林生续断苷I为237nm，马钱子苷为246nm，5-羟甲基-2-呋喃甲醛为284nm；
测定方法：精密吸取混合对照品溶液和续断供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，以外标法计算续断中川续断皂苷VI、续断苷A、续断苷B、当药苷、马钱甘酸、林生续断苷I、马钱子苷、5-羟甲基-2-呋喃甲醛的含量。


8.一种续断药材化合物，其特征在于，所述化合物的特征具体为：
川续断皂苷VI的特征为：分子式C47H76O18，在[M+Na]+和[M+H]+的正离子模式下误差分别为-1.4278、-2.3033；
续断苷A或续断苷B的特征为：分子式C66H90O37，在[M-H]-的负离子模式下误差为0.0386；
当药苷的特征为：分子式C16H22O9，在[M+Na]+和[M+H]+的正离子模式下误差分别为-1.7689、-1.8463；
马钱甘酸的特征为：分子式C16H24O10，在[M-H]-的负离子模式下误差为1.4571；
林生续断苷I的特征为：分子式C33H48O19，在[M+H]+的正离子模式下误差为-2.6074；
马钱子苷的特征为：分子式C17H26O10，在[M+Na]+的正离子模式下误差为-1.4843；
5-羟甲基-2-呋喃甲醛的特征为：分子式C6H6O3，在[M+H]+的正离子模式下误差为-0.9582。


9.一种确认权利要求8所述续断药材中化合物的方法，其特征在于：利用HPLC-ESI-MS法对续断中8个化合物结构确认，具体方法为：
对照品溶液制备包括以下步骤：取各对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制成1.0520mg/mL川续断皂苷VI、1.0160mg/mL续断苷A、0.9700mg/mL续断苷B、1.2060mg/mL当药苷、1.1090mg/mL马钱甘酸、1.0800mg/mL林生续断苷I、1.0060mg/mL马钱子苷及1.0240mg/mL5-羟甲基-2-呋喃甲醛各对照品储备液；取各对照品储备液适量，精密量取，加甲醇稀释，制成0.1052mg/mL川续断皂苷VI、0.0508mg/mL续断苷A、0.0369mg/mL续断苷B、0.0603mg/mL当药苷、0.0554mg/mL马钱甘酸、0.0540mg/mL林生续断苷I、0.0503mg/mL马钱子苷及0.0512mg/mL5-羟甲基-2-呋喃甲醛的对照品混合溶液，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得检测用混合对照品溶液；
供试品溶液的制备包括以下步骤：取续断样品细粉0.4～0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20～40％乙醇25mL，密塞，称定重量，浸泡20～40min后，在温度为35℃、功率为250W、频率为40KHz的条件下超声处理20～40min，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置25mL容量瓶中，用提取溶剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
色谱条件色谱条件：以C18为色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸为流动相B进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～5min，10％A，90％B；5～12min，10％～13.3％A，90％～86.7％B；12～23min，13.3％A，86.7％B；23～45min，13.3％～3...

【专利技术属性】
技术研发人员：周涛，杨昌贵，肖承鸿，龚安慧，江维克，
申请(专利权)人：贵州中医药大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52