optrA耐药蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测细菌中optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，包括包被有单克隆抗体5C6的酶标板、检测抗体2F3‑HRP、optrA蛋白。本发明专利技术选用5C6作为捕获抗体，2F3‑HRP作为检测抗体研制了optrA双抗夹心ELISA检测试剂盒，并对其进行了方法学系统评估，结果显示试剂盒特异性好，灵敏度高，为optrA阳性耐药菌的快速检测提供了一种技术手段。

Detection kit and method of double anti sandwich ELISA for Optra resistant protein

【技术实现步骤摘要】
optrA耐药蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种用于检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及方法，属于免疫学分析

技术介绍
optrA基因由我国学者于2015年从1株临床分离的粪肠球菌09E349中首次发现，并且已被证明还可以介导细菌对氟化和非氟化氯霉素的耐药性。研究表明，optrA属于ABC蛋白家族，是一种新发现的耐药蛋白，既可介导肠球菌对恶唑烷酮类和利胆醇类抗生素的耐药性，还可以介导金黄色葡萄球菌对氯霉素类的耐药性。optrA被确定存在于中国的人源和动物源的肠球菌中，在中国，人源的主要分布于江西、天津、浙江；动物源的主要分布在河南、山东、上海、广东、西藏。自optrA首次在中国报道后，世界范围内多个国家开始检出optrA阳性的肠球菌，并且在部分国家临床和动物来源菌株（如波兰、哥伦比亚）检出的携带optrA基因的质粒与pE349有很高的相似性，这提示可能存在人畜之间的传播。2016年，意大利也发现了携带optrA基因的肠球菌。由于肠球菌的感染已经成为疾病治疗中的主要问题之一，因此耐药基因op本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体5C6的酶标板、检测抗体2F3-HRP、optrA蛋白标准品。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体5C6的酶标板、检测抗体2F3-HRP、optrA蛋白标准品。


2.根据权利要求1所述的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
所述捕获抗体5C6和检测抗体2F3为采用optrA重组蛋白免疫小鼠，经融合、克隆、筛选，得到的。


3.根据权利要求1或2所述的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
所述单克隆抗体5C6的重链可变区的氨基酸序列为序列2；
所述单克隆抗体5C6的轻链可变区的氨基酸序列为序列3；
所述单克隆抗体2F3的重链可变区的氨基酸序列为序列4；
所述单克隆抗体2F3的轻链可变区的氨基酸序列为序列5。


4.根据权利要求2所述的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
PCR扩增目的片段并克隆至表达载体pET28a，将成功构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，经亲和层析和分子筛层析高度纯化后得到optrA、重组蛋白。


5.根据权利要求4所述的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，重组optrA蛋白氨基酸序列为序列1。


6.根据权利要求1所述的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体2F3-HRP制备步骤包括：
（1）称取5mgHRP溶于1mL三蒸水中，逐滴缓慢加入0.20mL新配的0.1MNaIO4溶液，4℃避光搅拌25min，活化HRP，颜色由棕色变为绿色；上述溶液装入透析袋中，用1M，pH为4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，10000r/min，4℃，10min，离心去除沉淀；得到透析后的HRP；
（2）将单克隆抗体5C6抗体用0.2M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到透析后的抗体；
（3）将透析后的HRP加入0.16M乙二醇（每mg酶加0.1mL），4℃避光搅拌1h，然后加入透析后的抗体；两者混匀后用0.05M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到HRP-抗体混合液；
（4）对0.15MpH7.4PBS透析过夜；搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸氨，4℃避光搅拌3h；4℃，10000rpm离心15min，弃上清；PBS溶解沉淀，得到经辣根过氧化物酶标记的检测抗体2F3-HRP，使用酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘河冰，马立才，杨柳，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11