NDM-1耐药蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测细菌中NDM‑1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，包括包被有单克隆抗体3H5的酶标板、检测抗体4G1‑HRP、NDM‑1蛋白。本发明专利技术选用3H5作为捕获抗体，4G1‑HRP作为检测抗体研制了NDM‑1双抗夹心ELISA检测试剂盒，并对其进行了方法学系统评估，结果显示试剂盒特异性好，灵敏度高，为NDM‑1阳性耐药菌的快速检测提供了一种技术手段。

Detection kit and method of NDM-1 resistance protein double anti sandwich ELISA

【技术实现步骤摘要】
NDM-1耐药蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，属于免疫学分析

技术介绍
随着微生物与人类的不断斗争，在抗菌药物的使用过程中无可避免的会有“超级细菌”的出现。所谓的“超级细菌”并不仅仅单指一种细菌的名称，而是一类几乎对所有抗生素都有强劲耐药性的细菌统称。新德里金属β-内酰胺酶(NewDelhimetallo-beta-lactamase,NDM)是一种新型的碳青霉烯酶，于2009年首次从印度新德里一名患者体内的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中分离得到。由于该类细菌对包括碳青霉烯类药物在内的所有β-内酰胺类抗菌药物均耐药，且携带耐氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素基因，导致其感染治疗十分困难。因此也被称为“超级细菌”，也以其发现地新德里命名。2012年中国农业大学研究人员对北京周边养殖场和屠宰场样品携带blaNDM-1基因的细菌进行检测，检测到一株产NDM-1的鲁氏不动杆菌。这也是中国首次在动物养殖场中发现，由此表明NDM-1基因在动物中传播具有潜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体3H5的酶标板、检测抗体4G1-HRP、NDM-1蛋白标准品。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体3H5的酶标板、检测抗体4G1-HRP、NDM-1蛋白标准品。


2.根据权利要求1所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
所述捕获抗体3H5和检测抗体4G1为采用NDM-1重组蛋白免疫小鼠，经融合、克隆、筛选，得到的。


3.根据权利要求1或2所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
所述单克隆抗体3H5的重链可变区的氨基酸序列为序列2；
所述单克隆抗体3H5的轻链可变区的氨基酸序列为序列3；
所述单克隆抗体4G1的重链可变区的氨基酸序列为序列4；
所述单克隆抗体4G1的轻链可变区的氨基酸序列为序列5。


4.根据权利要求2所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
重组NDM-1(29-270)蛋白为通过截断NDM-1序列，N端添加GST标签，克隆至表达载体pGS-21a，并转化入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌株中，经IPTG诱导表达，使用Ni-NTA镍柱纯化得到的。


5.根据权利要求4所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，重组NDM-1(29-270)蛋白氨基酸序列为序列1。


6.根据权利要求1所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体4G1-HRP的制备方法步骤包括：
（1）称取5mgHRP溶于1mL三蒸水中，逐滴缓慢加入0.2mL新配的0.1MNaIO4溶液，4℃避光搅拌25min，活化HRP，颜色由棕色变为绿色；上述溶液装入透析袋中，于1MpH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃过夜透析，然后10000r/min，4℃，离心10min，去除沉淀；得到透析后的HRP；
（2）将单克隆抗体4G1置于0.2MpH9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到透析后的抗体；
（3）将透析后的HRP加入0.16M乙二醇（每mg酶加0.1mL），4℃避光搅拌1h，然后加入透析后的抗体；两者混匀后用0.05M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到HRP-抗体混合液；
（4）再于0.15MpH7.4PBS透析过夜；搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸氨，4℃避光搅拌3h；4℃，10000rpm离心15min，弃上清；PBS溶解沉淀，得到经辣根过氧化物酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：马立才，刘河冰，崔乃元，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11