一种利用固定化微球生产γ-氨基丁酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用固定化微球生产γ‑氨基丁酸的方法，具体涉及从L.plantarum Yll.03染色体基因组中克隆得到目的基因gadB，构建重组载体，并将该重组载体电击转入如乳酸乳球菌细胞中，用于重组GAD的表达及获取；以结冷胶为材料，利用固定化酶技术实现GAD的包埋；最终，将固定化微球投入米醋和味精混合液中，用于催化生成GABA。

A method of producing \u03b3 - aminobutyric acid by immobilized microspheres

【技术实现步骤摘要】
一种利用固定化微球生产γ-氨基丁酸的方法
本专利技术属于微生物发酵与固定化酶领域，涉及一种利用固定化微球生产γ-氨基丁酸的方法。
技术介绍
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)是一种在动物、植物及微生物体内广泛存在的非蛋白质氨基酸，又称氨酪酸、哌啶酸。GABA是哺乳动物体内主要的抑制性神经递质，具有延缓大脑衰老、降血压、治疗神经疾病、抗心律失常等多种生理功能；且在改善糖尿病人的生理状况、改善脂质代谢、防止动脉硬化、改善肝肾机能和抑制癌细胞生长等方面展现出较高的功能价值；因而，在食品、医药及化工等领域具有广阔的应用前景。目前，GABA的制备方法主要有化学合成法和生物合成法两大类。化学合成法反应速度快、产量高，但其普遍存在能耗高、反应条件苛刻、副产物多以及环境污染大等问题；且所制备的GABA不能用于食品工业和饲料领域，应用范围较窄。生物合成法由细胞中谷氨酸脱羧酶(GAD)所介导，其催化L-谷氨酸脱羧生成GABA。研究显示，GAD广泛存在于细菌、酵母和丝状真菌等各种微生物中。利用GAD或含有GAD的微生物转化制备GABA，不受资源、环境和空间等限制，已成为近年来生产GABA的研究热点。目前已有多种微生物，包含食品级微生物(如乳酸菌)发酵制备GABA的相关研究；此外，采用壳聚糖、海藻酸钙及羧基磁珠等材料实现GAD固定化亦有诸多报道。然而，上述报道中的GAD来源及反应体系罕有完全达到食品级制备体系。本专利技术突破上述屏障，提供一种利用固定化GAD酶催化生产食品级GABA的新方法，该方法大幅提升了固定化酶的稳定性，实现了不同含量食品级GABA的制备。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种生产食品级γ-氨基丁酸的方法，该方法产生的γ-氨基丁酸可以直接服用。本专利技术的目的之二在于提供一种谷氨酸脱羧酶的固定化微球及其制备方法，所述固定化微球具有较高的稳定性。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种生产γ-氨基丁酸的方法，包括步骤：1)构建含谷氨酸脱羧酶基因的重组菌株，诱导表达谷氨酸脱羧酶；2)分离纯化表达的谷氨酸脱羧酶；3)制备谷氨酸脱羧酶的固定化微球；4)使用固定化微球催化谷氨酸钠产生γ-氨基丁酸。进一步，步骤1)中重组菌株的构建包括：1)将植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因连接至载体上，构建重组质粒；2)将重组质粒转染到乳酸乳球菌中，构建重组菌株。进一步，1)中所述的载体为pNZ8148，谷氨酸脱羧酶基因进一步，2)中所述的乳酸乳球菌为LactococcuslactisNZ9000。在本专利技术的具体实施方式中，谷氨酸脱羧酶基因序列的Genebank登录号为：MN661347,核苷酸序列见SEQIDNO.3，菌株L.plantarumYll.03的16SrDNA部分序列的GeneBank登录号为：MN636335，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步，构建重组质粒时，扩增谷氨酸脱羧酶基因的引物序列如SEQIDNO.1～2所示。进一步，步骤1)中采用nisin进行诱导表达。优选的，nisin的终浓度为10ng/mL。在本专利技术的具体实施方式中，诱导表达的具体过程如下：将重组工程菌株接种于5mL的GM17液体培养基中，30℃静置培养24h后将种子液按体积分数2％的接种量接种于200mLGM17培养基中，30℃静置继续培养至菌液OD600达到0.4左右(接种4-6h)，向发酵液中加入终浓度为10ng/mL的nisin并继续培养7-10h。优选的，GM17培养基成分如下：动物蛋白胨2.5g/L、胰蛋白胨2.5g/L、大豆蛋白胨5g/L、牛肉提取物5g/L、酵母提取物2.5g/L、抗坏血酸0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、β-甘油磷酸钠五水合物19g/L、乳糖5g/L、葡萄糖5g/L，pH值为：7.1±0.2。进一步，步骤2)中分离纯化步骤包括：1)离心收获菌体细胞；2)超声破碎菌体细胞；3)收获细胞破碎上清液；4)采用亲和层析分离纯化谷氨酸脱羧酶。进一步，超声条件为：功率400W，工作3s，间歇6s，超声30min。进一步，步骤3)中制备谷氨酸脱羧酶固定化微球方法包括：1)将结冷胶加入去离子水中，搅拌均匀；2)加入纯化的谷氨酸脱羧酶，并混合均匀；3)将混合液逐滴加入CaCl2溶液中；4)磁力搅拌使其硬化，形成固定化微球。进一步，2)中谷氨酸脱羧酶的终浓度为14-15μg/mL。进一步，4)中磁力搅拌的条件为25℃、150rpm。进一步，CaCl2溶液的浓度为0.2M。进一步，3)中利用50mL的注射器与21G针头挤压混合液逐滴加入CaCl2溶液中。进一步，步骤4)中的催化pH为4.0-5.5。进一步，pH为pH4.0-4.7。进一步，调节pH的试剂为醋酸。进一步，所述醋酸为食用醋，包括但不限于米醋、白醋、香醋、陈醋。进一步，步骤4)中催化温度为25-50℃。进一步，催化温度为25-42℃。本专利技术提供了一种谷氨酸脱羧酶的固定化微球，该固定化微球的制备方法如下：1)将结冷胶加入去离子水中，搅拌均匀；2)加入纯化的谷氨酸脱羧酶，并混合均匀；3)将混合液逐滴加入CaCl2溶液中；4)磁力搅拌使其硬化，形成固定化微球。进一步，2)中谷氨酸脱羧酶的终浓度为14-15μg/mL。进一步，4)中磁力搅拌的条件为25℃、150rpm。本专利技术提供了上述谷氨酸脱羧酶的固定化微球在制备γ-氨基丁酸中的应用。进一步，将谷氨酸脱羧酶的固定化微球加入到含有谷氨酸钠的溶液中催化产生γ-氨基丁酸。本专利技术的优势及有益效果：本专利技术首次提供了一种谷氨酸脱羧酶的固定化微球及制备方法，所述固定化微球具有较高的稳定性，可以长时间保存。本专利技术首次提供了一种生产食品级GABA的方法，通过构建重组乳酸菌菌株过表达谷氨酸脱羧酶，分离纯化过表达的谷氨酸脱羧酶并利用结冷胶制备固定化微球，最终，将固定化微球投入玫瑰米醋和味精混合液中催化生成食品级GABA。该方法不仅可以实现工业化应用，同时可以进行自生产。附图说明图1是植物乳杆菌L.plantarumYll.03的扫描电镜图；图2是GAD的SDS-PAG图，其中，M为marker，1，2，3为纯化的GAD；图3是GAD固定化微球的扫描电镜图；图4是pH和温度对固定化微球的酶活的影响图，其中图A是温度为40℃时，不同pH对固定化微球的酶活的影响图，图B是pH为4.7时，不同温度对固定化微球的酶活的影响图；图5是GABA的HPLC检测图；图6是不同催化体系对GABA含量的影响图；图7是GAD的稳定性检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括步骤：/n1)构建含谷氨酸脱羧酶基因的重组菌株，诱导表达谷氨酸脱羧酶；/n2)分离纯化表达的谷氨酸脱羧酶；/n3)制备谷氨酸脱羧酶的固定化微球；/n4)使用固定化微球催化谷氨酸钠产生γ-氨基丁酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括步骤：
1)构建含谷氨酸脱羧酶基因的重组菌株，诱导表达谷氨酸脱羧酶；
2)分离纯化表达的谷氨酸脱羧酶；
3)制备谷氨酸脱羧酶的固定化微球；
4)使用固定化微球催化谷氨酸钠产生γ-氨基丁酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中重组菌株的构建包括：
1)将植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因连接至载体上，构建重组质粒；
2)将重组质粒转染到乳酸乳球菌中，构建重组菌株；
优选的，1)中所述的载体为pNZ8148；优选的，2)中所述的乳酸乳球菌为LactococcuslactisNZ9000；更为优选的，构建重组质粒的引物序列如SEQIDNO.1～2所示。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中采用nisin进行诱导表达，优选的，nisin的终浓度为10ng/mL。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中分离纯化步骤包括：
1)离心收获菌体细胞；
2)超声破碎菌体细胞；
3)收获细胞破碎上清液；
4)采用Ni-NTA亲和层析分离纯化谷氨酸脱羧酶；
优选的，超声条件为：功率400W，工作3s，间歇6s，超声30min。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹宏伟，姚丽莉，李钰昌，郭德轩，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23