通过限制培养基中的氨量来提高微生物细胞对邻氨基苯甲酸的耐受性的方法技术

本发明专利技术涉及通过限制培养基中的氨浓度来增加给定微生物细胞耐受的邻氨基苯甲酸浓度的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过限制培养基中的氨量来提高微生物细胞对邻氨基苯甲酸的耐受性的方法本专利技术涉及通过限制培养基中的氨浓度来增加给定微生物细胞耐受的邻氨基苯甲酸浓度的方法。目前，没有商购可得的邻氨基苯甲酸盐或相应酸的可再生的或生物衍生的来源。当前的苯胺生产方法依赖于石油衍生原料的化学合成。与可再生的原料如可再生资源"生物质"相反，这种石油衍生原料是不可再生的。苯胺的化学合成是一个多步骤过程。苯胺生产中涉及的几个反应步骤导致高的生产成本。此外，常规的（即化学的）苯胺合成与危险的中间体、溶剂和废产物有关，它们能够对环境具有重大影响。芳环上的非特异性副反应导致产物收率的降低，因此进一步增加了生产成本。石油衍生原料受全球石油价格导致的成本波动的影响。邻氨基苯甲酸和/或盐（o-aminobenzoate）是莽草酸（shikimateacid）途径的天然中间体，并且是用于芳族氨基酸L-色氨酸的生物合成的前体。WO2015/124687公开了一种以两个过程步骤生产生物衍生的苯胺的概念：(1)使用重组细菌发酵生产邻氨基苯甲酸和/或盐（o-aminobenzoate）和(2)随后将邻氨基苯甲酸催化转化为苯胺。用于所述过程中的重组细菌属于棒状杆菌（Corynebacterium）或假单胞菌（Pseudomonas）科。两种细菌在7至8的pH值下都生产邻氨基苯甲酸和/或盐。当在7至8范围内的pH下生产邻氨基苯甲酸和/或盐时存在以下问题：由于发酵生产邻氨基苯甲酸（o-aminobenzoate），其是一种酸，需要添加碱如NH4OH以确保稳定的中性pH。因此，产生例如NH4+/邻氨基苯甲酸根-的盐。然而，这样的邻氨基苯甲酸盐对微生物细胞是有毒的。根据图3，当达到大于25g/L邻氨基苯甲酸根（o-aminobenzoate）(不包括阳离子的质量)的NH4+/邻氨基苯甲酸根（o-aminobenzoate）浓度时，细菌细胞的代谢活性(见OTR)受到限制，并且细胞生长(见干重)在更高浓度(＞50g/L)下停止。对于产物如谷氨酸或赖氨酸而言，这种毒性是未知的。这种类型的毒性问题通常通过所应用的微生物细胞的直接进化来解决。首先，在重复的分批实验或连续发酵试验中，将微生物细胞暴露于浓度增加的毒性组分(例如邻氨基苯甲酸和/或盐)。由此，微生物细胞通过随机诱变(其可以通过添加诱变剂来加速)进化，并且更耐受的微生物细胞得以存活。其次，分离/选择最耐受的细胞，并可将其用于生产。然而，作为这些微生物细胞中的耐受性的基础的许多机制消耗能量(AindrilaMukhopadhyay，TrendsinMicrobiology，2015年8月，第23卷，第8号；Rau等人，MicrobCellFact(2016)15:176;WarneckeT,GillRT.MicrobialCellFactories.2005;4:25)。因此，消耗一定比例的可发酵底物用于维持代谢，导致邻氨基苯甲酸和/或盐的产率降低。由于这个原因，该过程的合理的空时产率所需要的邻氨基苯甲酸和/或盐的高滴度伴随地降低了产物产率。尽管由可再生来源以生物技术生产邻氨基苯甲酸和/或盐作为用于苯胺生产的前体提供了潜在的益处，但是上述毒性因素减少了该过程的潜在益处。因此，需要用于增加微生物细胞对邻氨基苯甲酸的耐受性的替代方法。所述问题通过权利要求书和以下的说明书中定义的实施方案来解决。在第一实施方案中，本专利技术涉及用于培养至少一种微生物细胞的方法，所述微生物细胞能够在可发酵底物的存在下将可发酵底物转化为oAB，同时维持其代谢活性，其中培养基的特征在于不超过200mM的氨浓度和至少40g/l的邻氨基苯甲酸(oAB)浓度。优选地，该实施方案中的oAB浓度为40g/l至80g/l，更优选40g/l至70g/l，和更优选40g/l至60g/l。在该实施方案中，所述代谢活性优选是通过培养物的氧转移速率(OTR)确定的氧消耗。所述"培养物"是由至少一种微生物细胞和培养基组成的悬浮液。一种或多种细胞的维持的代谢活性通过培养物的OTR没有降低来表明。优选地，维持的代谢活性是培养物的OTR增加。在上述培养条件下（Und），所述微生物细胞将至少一部分可发酵底物转化为oAB。因此，在另一个实施方案中，本专利技术涉及用于通过在可发酵底物的存在下和在适于可发酵底物转化为oAB的条件下培养能够将可发酵底物转化为oAB的微生物细胞来生产邻氨基苯甲酸(oAB)的方法，其中培养基中的氨浓度不超过200mM且oAB浓度为至少40g/l。优选地，该实施方案中的oAB浓度为40g/l至80g/l，更优选40g/l至70g/l，和更优选40g/l至60g/l。所述微生物细胞是，优选地，能够将可发酵底物生物转化为oAB的细胞。术语"生物转化"是指将可发酵底物的一种或多种分子转化为一种或多种分子oAB的生物化学过程。这些过程主要由通过细菌细胞表达的酶来介导。本申请中所提及的术语"邻氨基苯甲酸"(或oAB)涉及2-氨基苯甲酸。该化合物也称为邻氨基苯甲酸（anthranilicacid）。本领域技术人员知道酸可以以其质子化形式作为中性物质存在或去质子化作为阴离子存在。在水溶液中，一部分酸是质子化的，一部分作为阴离子存在。质子化酸和阴离子之间的比例取决于溶液的pH和所讨论的酸的解离常数Ka。除非另有说明，否则本申请中使用的术语"邻氨基苯甲酸"始终是指质子化的酸以及相应的阴离子两者。本专利技术中使用的微生物细胞可以是天然存在的菌株，即没有任何进一步的人类交互作用（特别是没有遗传操作）的能够将可发酵底物转化为oAB的微生物菌株。然而，在本专利技术的一个优选实施方案中，其是在遗传操作过程中获得上述能力的微生物细胞或是使用这些方法来改善预先存在的能力的微生物细胞。在本专利技术含义内的术语"遗传修饰"是指与野生型序列相比，在微生物宿主给定基因的核酸序列中的改变。这种遗传修饰可以包括一个或多个脱氧核糖核酸的缺失以及插入。这种遗传修饰可以包括部分的或完全的缺失以及通过转化引入到微生物宿主的基因组中的插入。这种遗传修饰可产生重组微生物宿主，其中所述遗传修饰可包括与各自的微生物宿主的野生型序列相比至少一个、两个、三个、四个或更多个单核苷酸的改变。例如，遗传修饰可以是缺失或插入至少一个、两个、三个、四个或更多个单核苷酸，或转化至少一个、两个、三个、四个或更多个单核苷酸。根据本专利技术的遗传修饰可以具有例如各自的基因的表达降低或例如各自的基因的表达增强的效果。所述微生物细胞是原核细胞或真核细胞。优选地，所述原核细胞是细菌细胞。优选的细菌细胞属于棒状杆菌属、分枝杆菌（Mycobacterium）属、芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属、埃希氏菌（Escherichia）属和弧菌（Vibrio）属。更优选谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）和恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）。最优选谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。优选的真核细胞属于酵母（Saccharomycetales）目或曲霉（Aspergi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于培养至少一种微生物细胞的方法，所述微生物细胞能够在可发酵底物的存在下将可发酵底物转化为oAB，同时维持其代谢活性，其中培养基的特征在于不超过200 mM的氨浓度和至少40 g/l的邻氨基苯甲酸(oAB)浓度。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171012 EP 17196153.51.用于培养至少一种微生物细胞的方法，所述微生物细胞能够在可发酵底物的存在下将可发酵底物转化为oAB，同时维持其代谢活性，其中培养基的特征在于不超过200mM的氨浓度和至少40g/l的邻氨基苯甲酸(oAB)浓度。


2.权利要求1的方法，其中维持的代谢活性通过培养物的氧转移速率没有降低来表明。


3.用于生产邻氨基苯甲酸(oAB)的方法，其通过在可发酵底物的存在下和在适于可发酵底物转化为oAB的条件下培养能够将可发酵底物转化为oAB的微生物细胞，其中培养基中的氨浓度不超过200mM且oAB浓度为至少40g/l。


4.权利要求2的方法，其中培养基中的氨浓度不超过5mM。


5.权利要求3或4的方法，其中oAB浓度不超过80g/l。


6.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：G耶格，W克莱克纳，S贝恩肯，S克拉费尔，J扎西，
申请(专利权)人：科思创德国股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE