一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5‑戊二胺的方法，所述的方法为构建表达木糖脱氢酶xylb和赖氨酸脱羧酶CadA的基因工程菌，将基因工程菌制得的种子液接种至含有玉米芯水解液的发酵培养基中发酵生产1,5‑戊二胺。与现有技术中直接以木糖为碳源，1,5‑戊二胺产量为8.82g/L，木糖与戊二胺的质量转化率为0.44g/g，本发明专利技术以玉米芯水解液作为碳源，1,5‑戊二胺产量为15.7g/L，水解液中的木糖与戊二胺的质量转化率为0.36g/g。玉米芯比木糖价格低廉，相同成本下使用玉米芯水解液替代木糖具有客观的经济效益，且利用废弃农作物对环境友好。

One step fermentation of xylose from corn cob hydrolysate to produce 1,5-pentanediamine

【技术实现步骤摘要】
一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法。
技术介绍
1,5-戊二胺，即尸胺是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成。在农业上，其可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育、改善植物果实发育、提高果实产量；在医学上，其可作为一种有效治疗痢疾的药物；在工业上，将1,5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料新型尼龙，被广泛应用于航空航天,汽车部件、机械零部件、电子电器、包装材料、胶粘剂及化妆品等领域。目前生物法生产戊二胺主要集中于两条途径：一种是酶法生产戊二胺，即用赖氨酸脱羧酶或含有赖氨酸脱羧酶的细胞来催化L-赖氨酸生成戊二胺；另一种是选择合适的微生物，以葡萄糖为原料，直接发酵生产戊二胺。酶法生产戊二胺条件复杂，需要添加多种辅因子，难以投入大规模生产。利用微生物直接发酵生产戊二胺成本低廉，有利于大规模生产。目前利用生物法转化可再生资源或废弃资源来生产1,5-戊二胺具有污染小、环境友好、可持续发展等优点。木质纤维素原料充足而廉价，如果能将之利用，不仅改善了农作物废物燃烧对大气的环境污染，也提高了废弃物的经济价值，同时为能源紧缺提供一条可持续发展道路。玉米芯中含有丰富的半纤维素主要成分为木糖，将玉米芯经过酸处理水解能得到大量木糖。目前1,5-戊二胺的发酵生产方面的研究主要集中在以葡萄糖等单糖为原料上，还未有利用大肠杆菌以木糖为单一碳源发酵生产戊二胺的技术，同时以利用废弃玉米芯中木糖为碳源大肠杆菌发酵生产戊二胺还未见报道。木糖相比于葡萄糖价格低廉，且在废弃农作物中储存量大，利用玉米芯中木糖生产戊二胺不仅能大大降低1,5-戊二胺的生产成本，还可以提高废弃农作物的利用率，对环境十分友好。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法，打通了大肠杆菌中以木糖为碳源发酵生产1,5-戊二胺的途径，利用玉米芯水解液中的木糖为碳源，降低了1,5-戊二胺的发酵成本。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法，其包括如下步骤：构建表达木糖脱氢酶xylb和赖氨酸脱羧酶CadA的基因工程菌，将基因工程菌制得的种子液接种至含有玉米芯水解液的发酵培养基中发酵生产1,5-戊二胺。其中，所述的表达木糖脱氢酶xylb和赖氨酸脱羧酶CadA的基因工程菌中，木糖脱氢酶，GeneID:7329904；赖氨酸脱羧酶，GeneID:948643。其中，所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：(1)构建重组质粒pCDFduet-CadA和重组质粒pTRC99a-xylb；(2)构建大肠杆菌。步骤(1)中，所述重组质粒pCDFduet-CadA的构建方法为将来源于大肠杆菌MG1655的赖氨酸脱羧酶的基因CadA，两端设计酶切位点NotIII和BglII，亚克隆到载体pCDFduet上，获得重组质粒pCDFduet-CadA。步骤(1)中，所述重组质粒pTRC99a-xylb的构建方法为将来源于Caulobactercrescentus的木糖脱氢酶的基因xylb，两端设计酶切位点SacI和SalI，亚克隆到载体pTRC99a上，得到重组质粒pTRC99a-xylb；步骤(2)中，重组大肠杆菌的构建方法为将重组质粒pCDFduet-CadA和pTRC99a-xylb通过氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主Ecoli.NT1003，得到表达木糖脱氢酶和赖氨酸脱羧酶的基因工程菌。其中，所述的玉米芯水解液的制备方法为将玉米芯与稀硫酸混合后高温灭菌，再加入Ca(OH)2调节pH至7.0～7.5(优选7.2)，第一次过滤，向第一滤液中加入活性炭，加热，第二次过滤，所得第二滤液即为玉米芯水解液。其中，稀硫酸的体积分数为0.5％～3％(优选1％)，玉米芯与稀硫酸的质量体积比为150～200g/L(优选180g/L)；所述的高温灭菌为110～130℃灭菌15～30min(优选121℃灭菌20min)；活性炭与第一滤液的质量体积比为10～20g/L(优选20g/L)；所述的加热为40～60℃下加热20～40min(优选50℃加热30min)。其中，含有玉米芯水解液的发酵培养基中各组分的浓度为2g/L酵母粉，5g/L蛋白胨，10g/L硫酸铵，氯化钾0.5g/L，硫酸镁1.6g/L，硫酸亚铁32mg/L，硫酸锰32mg/L，硫酸铜77mg/L，硫酸锌86mg/L，维生素B160mg/L，烟酰胺10mg/L，生物素30μg/L，碳酸钙10g/L；溶剂为玉米芯水解液，灭菌备用。其中，种子液的制备方法为挑取单菌落，接入5mLLB培养基中，37℃，200rpm培养7-10h。其中，将基因工程菌制得的种子液按5％的体积比接种到含有玉米芯水解液的发酵培养基中。其中，，所述的发酵为37℃下发酵32～40h(优选26h)，发酵至10h时，向发酵培养基中加入IPTG至终浓度为1mmol/L。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：(1)本专利技术在大肠杆菌中构建了能够利用木糖作为单一碳源发酵生产1,5-戊二胺的途径，且所用木糖来自于玉米芯水解液，节约了生产成本，提高了1,5-戊二胺的产量，有应用于大规模生产的潜力。(2)直接以木糖为碳源，1,5-戊二胺产量为8.82g/L，木糖与戊二胺的质量转化率为0.44g/g。以玉米芯水解液作为碳源，1,5-戊二胺产量为15.7g/L，水解液中的木糖与戊二胺的质量转化率为0.36g/g。玉米芯比木糖价格低廉，相同成本下使用玉米芯水解液替代木糖具有客观的经济效益，且利用废弃农作物对环境友好。附图说明图1为以木糖为唯一碳源一步发酵生产1,5-戊二胺的产量。图2为利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产戊二胺的产量。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。以下实施例中如无特别说明，所用酶及质粒均为购买所得。实施例1：构建重组大肠杆菌(1)重组质粒pCDFduet-CadA的构建：将来源于大肠杆菌MG1655(购于武汉淼灵生物科技有限公司)的赖氨酸脱羧酶基因CadA，通过质粒小提试剂盒(TianGen)获取质粒，在酶切位点处酶切从而得到目的片段CadA，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。核酸胶验证且证明为目的条带并通过胶回收试剂盒(TianGen)回收目的基因。将质粒pCDFduet进行酶切(酶切位点为NotIII和BglII)，见表1；利用T4DNA连接酶将目的片段CadA与酶切好的质粒pCDFduet连接起来得到重组质粒pCDFd本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述的方法为构建表达木糖脱氢酶xylb和赖氨酸脱羧酶CadA的基因工程菌，将基因工程菌制得的种子液接种至含有玉米芯水解液的发酵培养基中发酵生产1,5-戊二胺。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述的方法为构建表达木糖脱氢酶xylb和赖氨酸脱羧酶CadA的基因工程菌，将基因工程菌制得的种子液接种至含有玉米芯水解液的发酵培养基中发酵生产1,5-戊二胺。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基因工程菌的构建方法包括如下步骤：
(1)构建重组质粒pCDFduet-CadA和重组质粒pTRC99a-xylb；
(2)构建大肠杆菌。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组质粒pCDFduet-CadA的构建方法为将来源于大肠杆菌MG1655的赖氨酸脱羧酶的基因CadA，两端设计酶切位点NotIII和BglII，亚克隆到载体pCDFduet上，获得重组质粒pCDFduet-CadA。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组质粒pTRC99a-xylb的构建方法为将来源于Caulobactercrescentus的木糖脱氢酶的基因xylb，两端设计酶切位点SacI和SalI，亚克隆到载体pTRC99a上，得到重组质粒pTRC99a-xylb。


5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，重组大肠杆菌的构建方法为将重组质粒pCDFduet-CadA和pTRC99a-xylb通过氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主Ecoli.NT1003，得到表达木糖脱氢酶和赖氨酸脱羧酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，李孟阳，王昕，黄劲松，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32