一种基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法技术

本发明专利技术公开了一种基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法，特别是利用人诱导多能干细胞原位生成的拟胚体诱导发育成为含有多细胞成分的胰岛类器官，该器官芯片为从可灌注多层荚膜三维组织培养芯片，通过灌注含有不同小分子诱导剂的分化培养基促进拟胚体向胰岛类组织分化。同时芯片上下层通道内同时灌注诱导分化培养基，灌注速率为100μL h

A method of constructing human islet like organ model based on organ chip

【技术实现步骤摘要】
一种基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法
本专利技术涉及将微流控芯片技术应用到体外构建人源器官模型的
，具体涉及一种基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法。
技术介绍
近年来糖尿病病发率急剧上升，已成为世界第三大慢性病严重威胁社会健康。糖尿病根据其发病机制不同可分为由胰岛素不足引起的1型糖尿病和由胰岛素抵抗引起的2型糖尿病。1型糖尿病是由自身免疫系统破坏机体胰腺组织β细胞，胰岛素分泌不足从而引发机体血糖升高。目前胰腺或胰岛移植是从根本上治疗1型糖尿病的主要方法，但由于供者数量缺乏，移植后免疫排斥反应等问题，限制该方法在临床治疗中的大规模应用。寻找一种功能、数量都与正常β细胞相匹配的替代细胞是亟待解决的问题。诱导型多能干细胞不仅能够体外诱导生成正常的心肌、神经、肝脏等细胞，还能够以患者体细胞为来源体细胞生成特异性的细胞类型。最新研究表明，以IPS细胞为基础发展出来的类器官模型，能够模拟出器官的发育形成过程，可定向向三胚层发育，含有多种细胞成分。这些都为疾病治疗、药物筛选和再生性医学提供新方法。IPS诱导胰岛技术因其细胞来源广，自体移植免疫排斥低等优点，是目前胰岛移植理想细胞来源，成为研究细胞治疗1型糖尿病的新热点。器官芯片技术飞速发展，因其能够多空间角度结合三维细胞基质，流体剪切力，氧浓度梯度等生物物理化学因素，已经在芯片上构建出功能良好的肺，心肌，肝等微器官模型。虽然，有一些报道应用微流控技术研究IPS诱导胰岛，此方法一定程度上促进胰岛诱导效率，但并未解决胰岛移植的根本问题。如何借助器官芯片技术建立体外功能良好的胰岛模型，大规模，稳定的胰岛细胞用于在糖尿病的治疗和药物测评，基础研究将是本次专利技术的重点。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种生物相容性和透光性良好的器官芯片以及基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法，可以大规模，稳定的将人干细胞来源的胰岛细胞用于在糖尿病的治疗和药物测评中。一种器官芯片，基于微流控芯片技术，该芯片主要由4层结构粘合封接而成，自上而下依次包括PDMS上层1，PDMS贯穿孔层2，聚碳酸酯膜层3，PDMS底层4；其中，所述PDMS上层1与PDMS贯穿孔层2封接相连；PDMS贯穿孔层2与聚碳酸酯膜层3通过PDMS胶体粘合连接，聚碳酸酯膜层3与PDMS底层4封接相连；所述PDMS上层1包含细胞入口池5，上层培养基灌流室6、废液池7和上层灌流通道14；所述上层培养基灌流室6上端与细胞入口池5相连，下端与废液池7相连；所述PDMS贯穿孔层2上设有细胞培养室8，PDMS贯穿孔层2上的贯穿孔与聚碳酸酯膜层3形成细胞培养小室13，细胞培养室8底部设有细胞培养室底9；所述细胞培养室8与细胞培养室底9通过PDMS粘合；所述PDMS底层4包括下层培养基入口池10，下层培养基灌流室11、下层废液池12和下层灌流通道15；所述下层培养基灌流室11上端与下层培养基入口池10相连，下端与下层废液池12相连；所述PDMS贯穿孔层2和聚碳酸酯膜层3多孔结构，实现上下层营养物和代谢产物的物质交换。所述细胞培养小室13的个数为100～200个。细胞培养小室13可进行编码，对单个干细胞来源的拟胚体进行原位诱导，并对发育过程，病理生理改变进行原位追踪观察。所述器官芯片上层灌流通道14和下层灌流通道15高度为300-500μm；所述细胞培养小室13半径为200-300μm，高度为250-400μm；PDMS贯穿孔膜2厚度为300μm，贯穿孔直径500μm；聚碳酸脂膜3厚度4-8nm，孔径4nm。本专利技术提供的器官芯片，细胞培养小室13底部结构为多孔膜结构，细胞培养小室13上层培养基灌流通道14和下层培养基灌流通道15可同时添加流体，可以实现上下层营养物和代谢产物的物质交换。一种基于器官芯片的多能干细胞来源的人胰岛类器官构建方法，采用了上述器官芯片，具体步骤如下：(1)将hiPSCs细胞悬液由细胞入口池5注入芯片上，静置10min将培养室外散在细胞冲出，过夜培养后形成拟胚体，灌注诱导培养基，开始胰岛类器官诱导；(2)人源诱导多能干细胞形成的拟胚体向胰岛类器官待诱导过程结束后，进行细胞死活染色实验验证细胞活性，蛋白及基因水平上鉴定胰岛的细胞种类，胰岛β细胞的成熟度，胰岛的内分泌功能，胰岛内分泌量及分泌时效性检测用以检测胰岛分泌功能。所述细胞为人来源的多能干细胞。所述人来源的多能干细胞为人胚胎干细胞hESCs、人诱导多能干细胞hiPSCs。所述步骤(2)检测胰岛分泌功能之前需要用含20-30mM葡萄糖的KRBH缓冲液处理。所述诱导培养基具体如下：第一阶段内胚层诱导：DMEM/F12基础培养基加0.2％BSA，50ng/mlactivinA，3μMCHIR99021，2mMLiCl处理一天；之后用DMEM/F12基础培养基加0.2％BSA，1％B27，和50ng/mlactivinA处理4天；第二阶段胰向内胚层诱导：DMEM基础培养基加0.5％B27，2μMretinoicacid，2μMdorsomorphin，10μMSB431542，5ng/mlbFGF和250nmSANT-1，维持6天；第三阶段向内分泌前体细胞诱导：DMEM基础培养基加0.5％B27s，50μg/mlascorbicacid，2μMdorsomorphin，10μMSB431542和10μMDAPT，维持4天；第四阶段向内分泌细胞诱导：CMRL1066基础培养基加0.5％B27supplement，0.5％penicillin–streptomycin，25mMglucose，2μMdorsomorphin，10μMSB431542，10mMnicotinamide和50μg/mlascorbicacid，维持8天。本专利技术提供了一种基于微流控芯片技术的可高通量获得一种干细胞来源的人胰岛类器官模型。本专利技术建立的体外干细胞来源的人胰岛类器官模型，含有两种主要胰岛组织细胞成分胰岛β细胞和胰岛α细胞。本专利技术建立的体外干细胞来源的人胰岛类器官模型，具有良好的胰岛素分泌功能，模拟体内生理条件下胰岛分泌胰岛素的糖刺激响应过程。本专利技术建立的体外干细胞来源的人胰岛类器官模型，类胰组织细胞有良好的细胞活力并且可实现体外长期培养至60天。本专利技术提供了一种基于微流控芯片技术的体外构建干细胞来源的人胰岛类器官的构建方法，所用起始细胞类型为人诱导多能干细胞(hiPSCs)。1)基于微流控芯片的人胰岛类器官芯片的构建利用器官芯片技术，多维结合三维细胞培养方式，流体剪切力，构建出功能hiPSc来源的胰岛类器官，所构建的类组织细胞成熟具有良好的胰岛素分泌功能，多细胞组分(胰岛β细胞、胰岛α细胞)，有效的糖刺激反应(GSIS反应)。阶梯式诱导的方法来模拟体内胰腺发育的过程，使多能性干细胞逐步经过内胚层细胞、胰岛前体细胞等阶段，最后发育为成熟胰岛β细胞。2)芯片上人胰岛类器官的功本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种器官芯片，其特征在于：该芯片主要由4层结构粘合封接而成，自上而下依次包括PDMS上层(1)，PDMS贯穿孔层(2)，聚碳酸酯膜层(3)，PDMS底层(4)；其中，所述PDMS上层(1)与PDMS贯穿孔层(2)封接相连；PDMS贯穿孔层(2)与聚碳酸酯膜层(3)通过PDMS胶体粘合连接，聚碳酸酯膜层(3)与PDMS底层(4)封接相连；/n所述PDMS上层(1)包含细胞入口池(5)，上层培养基灌流室(6)、废液池(7)和上层灌流通道(14)；所述上层培养基灌流室(6)上端与细胞入口池(5)相连，下端与废液池(7)相连；/n所述PDMS贯穿孔层(2)上设有细胞培养室(8)，PDMS贯穿孔层(2)上的贯穿孔与聚碳酸酯膜层(3)形成细胞培养小室(13)，细胞培养室(8)底部设有细胞培养室底(9)；所述细胞培养室(8)与细胞培养室底(9)通过PDMS粘合；/n所述PDMS底层(4)包括下层培养基入口池(10)，下层培养基灌流室(11)、下层废液池(12)和下层灌流通道(15)；所述下层培养基灌流室(11)上端与下层培养基入口池(10)相连，下端与下层废液池(12)相连；/n所述PDMS贯穿孔层(2)和聚碳酸酯膜层(3)多孔结构，实现上下层营养物和代谢产物的物质交换。/n...

【技术特征摘要】
1.一种器官芯片，其特征在于：该芯片主要由4层结构粘合封接而成，自上而下依次包括PDMS上层(1)，PDMS贯穿孔层(2)，聚碳酸酯膜层(3)，PDMS底层(4)；其中，所述PDMS上层(1)与PDMS贯穿孔层(2)封接相连；PDMS贯穿孔层(2)与聚碳酸酯膜层(3)通过PDMS胶体粘合连接，聚碳酸酯膜层(3)与PDMS底层(4)封接相连；
所述PDMS上层(1)包含细胞入口池(5)，上层培养基灌流室(6)、废液池(7)和上层灌流通道(14)；所述上层培养基灌流室(6)上端与细胞入口池(5)相连，下端与废液池(7)相连；
所述PDMS贯穿孔层(2)上设有细胞培养室(8)，PDMS贯穿孔层(2)上的贯穿孔与聚碳酸酯膜层(3)形成细胞培养小室(13)，细胞培养室(8)底部设有细胞培养室底(9)；所述细胞培养室(8)与细胞培养室底(9)通过PDMS粘合；
所述PDMS底层(4)包括下层培养基入口池(10)，下层培养基灌流室(11)、下层废液池(12)和下层灌流通道(15)；所述下层培养基灌流室(11)上端与下层培养基入口池(10)相连，下端与下层废液池(12)相连；
所述PDMS贯穿孔层(2)和聚碳酸酯膜层(3)多孔结构，实现上下层营养物和代谢产物的物质交换。


2.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于：所述细胞培养小室(13)的个数为100～200个。


3.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于：所述器官芯片上层灌流通道(14)和下层灌流通道(15)高度为300-500μm；所述细胞培养小室(13)半径为200-300μm，高度为250-400μm；PDMS贯穿孔膜(2)厚度为300μm，贯穿孔直径500μm；聚碳酸脂膜(3)厚度4-8nm，孔径4nm。


4.根据权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于：所述细胞培养小室(13)可进行编码，对单个干细胞来源的拟胚体进行原位诱导，并对发育过程，病理生理改变进行原位追踪观察。


5.根据权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于：所述上层灌流通道(14)和下层灌流通道(15)可同时添加流体，实现良好的物质交换。


6.一种基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法，其特征在于采用了权利要求1和2中任一种的芯片，具体步...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，陶婷婷，陈雯雯，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21