一种细胞内MTDH结合代谢物的鉴定方法技术

本发明专利技术公开一种利用经典的蛋白质亲和纯化手段结合灵敏的质谱分析，鉴定细胞内与MTDH发生原位结合的代谢物小分子的方法。具体采用表面装载链霉亲和素的琼脂糖珠，对细胞内表达有生物素片段的融合MTDH蛋白以及对照空载体表达蛋白进行亲和富集，同时结合蛋白免疫印迹实验证实蛋白质的亲和纯化结果，通过提取体系内代谢物并进行质谱鉴定，比较对照蛋白组与融合MTDH蛋白组的代谢物丰度差异，从而鉴定出可能与MTDH相互作用的代谢物，为后续深入展开生物大小分子功能相互干预相关研究提供指导。

A method for identification of intracellular mtdh binding metabolites

【技术实现步骤摘要】
一种细胞内MTDH结合代谢物的鉴定方法
本专利技术涉及到生物化学与分子生物学技术以及色谱质谱联用分析技术，具体涉及基于蛋白亲和富集与质谱分析联用的细胞内MTDH结合代谢物的鉴定方法，利用蛋白质亲和富集与气相色谱-质谱联用技术检测差异代谢物的方法。
技术介绍
生物分子之间的相互作用存在于细胞内一系列的生命过程中，其中备受关注的经常是蛋白质与蛋白质之间的相互作用，或者蛋白质与DNA或RNA之间的结合作用。而随着各种分析检测手段的发展，代谢物小分子与蛋白质之间的功能调控关系也渐渐进入研究者们的视野。近年来，越来越多的研究围绕生物大小分子相互作用鉴定的新方法建立以及深入的生物功能影响机制展开。鉴定蛋白质与代谢物相互作用的方法常见的有：1)通过特殊基质固载目的蛋白后与代谢物共孵育，经过洗脱提取等步骤鉴定与对照组出现差异的代谢物小分子来发现蛋白质代谢物的结合作用。该方法在分析的高通量方面有欠缺；2)基于化学蛋白质组学的活性蛋白质谱学技术，即通过设计活性的小分子探针，利用点击化学反应对蛋白质小分子结合体系进行富集，结合蛋白质组学技术筛选潜在的代谢物作用的蛋白质靶点；3)蛋白质的亲和富集结合灵敏的质谱检测手段，鉴定细胞内原位发生的蛋白质与代谢物的相互作用。而分析结果的假阳性率高是后面两种检测手段共有的特性，需要结合各种生物学功能实验做进一步验证。MTDH(metadherin，异黏蛋白)在多种恶性肿瘤中呈高表达状态,诸如前列腺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、肝癌、食管鳞状细胞癌、胃癌和非小细胞肺癌,并且与疾病的发展和不良的临床预后有关。围绕MTDH在多种肿瘤中的作用而展开的蛋白-蛋白相互影响的研究很多，但是参与其功能调控的生物小分子发现与机制研究相对较少。从蛋白质-代谢物相互作用的鉴定出发，发现与MTDH可能存在相互作用的代谢物可以为后续的生命基础研究，肿瘤的临床诊断与治疗，新药发现等方面提供重要指导。基于气相色谱-质谱技术(GC-MS)、液相色谱-质谱技术(LC-MS)和毛细管电泳-质谱技术(CE-MS)的代谢组学，是对某一生物或细胞内所有低分子质量代谢产物进行定性和定量分析的新学科。这种细胞内代谢物的灵敏检测手段为蛋白质-代谢物相互作用的鉴定提供强有力的辅助。
技术实现思路
本专利技术涉及细胞内与MTDH相互作用的代谢物的鉴定，目的一是阐明在亲和富集融合MTDH蛋白过程中，MTDH在细胞内原位结合的代谢物也随之被富集；目的二,为蛋白质与代谢物的相互调控在癌症治疗、药物靶点鉴定、新药发现等临床转化应用中的重要作用提供基础。实验结果表明，通过亲和富集融合MTDH蛋白，结合GC-MS分析，鉴定出胆固醇为MTDH可能结合的代谢物分子之一。一种基于蛋白亲和富集与质谱分析联用的细胞内MTDH结合代谢物的鉴定方法，包括如下步骤：融合MTDH蛋白与空载蛋白的亲和富集1)转染前一天接种40％-50％汇合度的HEK293T细胞于10cm细胞培养皿。2)在293T细胞中转染6-10μgSFB-N与SFB-MTDH质粒。3)转染48-60h后吸去培养基,加入5-8mlPBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭。4)每个培养皿加入1-1.2mlNETN细胞裂解液，破碎细胞，提取蛋白。5)每管蛋白裂解液中加入15-20μl链霉亲和素琼脂糖珠，4℃富集2-4h。空载蛋白与融合MTDH蛋白结合的代谢物提取与鉴定1)采用离心式过滤柱(Pierce，89868)分离琼脂糖珠-蛋白质-代谢物结合复合体与NETN裂解液。用500-800μlPBS(Hyclone，SH30256.01)，洗琼脂糖珠-蛋白质-代谢物结合复合体2-3次。2)200μl三蒸水重悬琼脂糖珠-蛋白质-代谢物结合复合体，加入800μl含有终浓度为5-10μg/ml正十三酸标准样品的甲醇(Merck，)静置提取30-50min。3)低速离心后，对照组与实验组分别取等体积的上清，真空浓缩干燥6-8h。4)采用基于TMS的两步衍生法对获得的代谢样品衍生并进行GC-MS分析。5)提取代谢物后的琼脂糖珠-蛋白质结合复合体进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上；6)利用Flag特异抗体，通过WesternBlot进行化学发光。本专利技术采用表面装载链霉亲和素的琼脂糖珠，对细胞内表达有生物素片段的融合MTDH蛋白以及对照空载体表达蛋白进行亲和富集，同时结合蛋白免疫印迹实验证实蛋白质的亲和纯化结果，通过提取体系内代谢物并进行质谱鉴定，比较对照蛋白组与融合MTDH蛋白组的代谢物丰度差异，从而鉴定出可能与MTDH相互作用的代谢物，为后续深入展开生物大小分子功能相互干预相关研究提供指导。附图说明图1为鉴定细胞内MTDH相互作用代谢物的实验流程。图2为WesternBlot验证蛋白亲和富集结果图；在HEK293T细胞中转染空载SFB-N作为阴性对照，转染另外的融合ERRα蛋白作为阳性对照，验证亲和富集效率。图3为GC-MS检测对照蛋白组与融合MTDH组样品的总TIC图。图4为代谢物胆固醇在对照蛋白组与融合MTDH组之间表现差异及对应的质谱图。比较对照蛋白组与融合MTDH组之间的代谢物，鉴定出胆固醇可能为MTDH结合的代谢物之一。(A)将对照蛋白组与融合MTDH组分析的TIC图叠加，其中红色曲线代表融合MTDH组的TIC图，黑色曲线代表对照蛋白组的TIC图。保留时间在48.1min-48.3min之间的色谱峰鉴定为胆固醇峰；(B)保留时间在48.1min-48.3min之间的对照蛋白组与融合MTDH组的色谱峰对应的质谱图比较。上方的图为对照蛋白组色谱峰对应的质谱图，未见明显的胆固醇特征碎片离子，如m/z129,m/z329,m/z368等。下方的图为融合MTDH蛋白组色谱峰对应的质谱图，出现明显的m/z129,m/z329,m/z368碎片。具体实施方式现结合实例，对本专利技术做进一步说明。实例仅限于说明本专利技术，而非对本专利技术的限定。SFB-MTDH的质粒构建1)空载质粒SFB-N(从别的实验室索取)。2)购买cDNA文库，通过PCR扩增带有attB保守序列的MTDH。设计引物序列如下：attB1-MTDH：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTGCACGGAGCTGGCAGattB2-MTDH：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCACGTTTCTCGTCTGGC3)BP反应：25℃反应6小时。转化至DH5α感受态，涂布卡那平板，37℃过夜，挑克隆，提质粒pDonar-MTDH，测序无误后进行下一步反应。4)LR反应：25℃反应6小时。转化至DH5α感受态，涂布氨苄平板，37本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞内MTDH结合代谢物的鉴定方法，其特征在于：/n1)利用蛋白质亲和纯化手段富集细胞内空载蛋白与融合MTDH蛋白；具体为：采用表面装载链霉亲和素的琼脂糖珠，对细胞内表达有生物素片段的融合MTDH蛋白以及对照空载体表达蛋白进行亲和富集；/n2)鉴定细胞内与MTDH发生原位结合的代谢物小分子；具体为：对代谢物进行质谱鉴定，比较对照蛋白组与融合MTDH蛋白组的代谢物丰度差异，从而鉴定出与MTDH相互作用的代谢物/n通过在HEK293T中过表达目的蛋白，结合免疫共沉淀的方法，获得较高含量的空载蛋白与融合MTDH蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞内MTDH结合代谢物的鉴定方法，其特征在于：
1)利用蛋白质亲和纯化手段富集细胞内空载蛋白与融合MTDH蛋白；具体为：采用表面装载链霉亲和素的琼脂糖珠，对细胞内表达有生物素片段的融合MTDH蛋白以及对照空载体表达蛋白进行亲和富集；
2)鉴定细胞内与MTDH发生原位结合的代谢物小分子；具体为：对代谢物进行质谱鉴定，比较对照蛋白组与融合MTDH蛋白组的代谢物丰度差异，从而鉴定出与MTDH相互作用的代谢物
通过在HEK293T中过表达目的蛋白，结合免疫共沉淀的方法，获得较高含量的空载蛋白与融合MTDH蛋白。


2.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：利用蛋白质亲和纯化手段富集细胞内空载蛋白与融合MTDH蛋白，包括以下步骤：
1)转染前一天接种HEK293T细胞于2个5-10cm细胞培养皿；
2)分别在293T细胞中转染6-10μgSFB-N与SFB-MTDH质粒；
3)转染48-60h后吸去培养基,加入5-8mlPBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；
4)每个培养皿加入1-1.2ml配制的NETN细胞裂解液，提取蛋白；
5)每管蛋白裂解液中加入15-20μl链霉亲和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王稳，朴海龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21