【技术实现步骤摘要】
一种细胞内MTDH结合代谢物的鉴定方法
本专利技术涉及到生物化学与分子生物学技术以及色谱质谱联用分析技术，具体涉及基于蛋白亲和富集与质谱分析联用的细胞内MTDH结合代谢物的鉴定方法，利用蛋白质亲和富集与气相色谱-质谱联用技术检测差异代谢物的方法。
技术介绍
生物分子之间的相互作用存在于细胞内一系列的生命过程中，其中备受关注的经常是蛋白质与蛋白质之间的相互作用，或者蛋白质与DNA或RNA之间的结合作用。而随着各种分析检测手段的发展，代谢物小分子与蛋白质之间的功能调控关系也渐渐进入研究者们的视野。近年来，越来越多的研究围绕生物大小分子相互作用鉴定的新方法建立以及深入的生物功能影响机制展开。鉴定蛋白质与代谢物相互作用的方法常见的有：1)通过特殊基质固载目的蛋白后与代谢物共孵育，经过洗脱提取等步骤鉴定与对照组出现差异的代谢物小分子来发现蛋白质代谢物的结合作用。该方法在分析的高通量方面有欠缺；2)基于化学蛋白质组学的活性蛋白质谱学技术，即通过设计活性的小分子探针，利用点击化学反应对蛋白质小分子结合体系进行富集，结合蛋白质组学技...
【技术保护点】
1.一种细胞内MTDH结合代谢物的鉴定方法，其特征在于：/n1)利用蛋白质亲和纯化手段富集细胞内空载蛋白与融合MTDH蛋白；具体为：采用表面装载链霉亲和素的琼脂糖珠，对细胞内表达有生物素片段的融合MTDH蛋白以及对照空载体表达蛋白进行亲和富集；/n2)鉴定细胞内与MTDH发生原位结合的代谢物小分子；具体为：对代谢物进行质谱鉴定，比较对照蛋白组与融合MTDH蛋白组的代谢物丰度差异，从而鉴定出与MTDH相互作用的代谢物/n通过在HEK293T中过表达目的蛋白，结合免疫共沉淀的方法，获得较高含量的空载蛋白与融合MTDH蛋白。/n
【技术特征摘要】
1.一种细胞内MTDH结合代谢物的鉴定方法，其特征在于：
1)利用蛋白质亲和纯化手段富集细胞内空载蛋白与融合MTDH蛋白；具体为：采用表面装载链霉亲和素的琼脂糖珠，对细胞内表达有生物素片段的融合MTDH蛋白以及对照空载体表达蛋白进行亲和富集；
2)鉴定细胞内与MTDH发生原位结合的代谢物小分子；具体为：对代谢物进行质谱鉴定，比较对照蛋白组与融合MTDH蛋白组的代谢物丰度差异，从而鉴定出与MTDH相互作用的代谢物
通过在HEK293T中过表达目的蛋白，结合免疫共沉淀的方法，获得较高含量的空载蛋白与融合MTDH蛋白。
2.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：利用蛋白质亲和纯化手段富集细胞内空载蛋白与融合MTDH蛋白，包括以下步骤：
1)转染前一天接种HEK293T细胞于2个5-10cm细胞培养皿；
2)分别在293T细胞中转染6-10μgSFB-N与SFB-MTDH质粒；
3)转染48-60h后吸去培养基,加入5-8mlPBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；
4)每个培养皿加入1-1.2ml配制的NETN细胞裂解液，提取蛋白；
5)每管蛋白裂解液中加入15-20μl链霉亲和...
【专利技术属性】
技术研发人员：王稳，朴海龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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