一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物制造技术

本发明专利技术涉及一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素‑大分子载体偶联复合物，所述凝集素‑大分子载体偶联复合物包括：大分子载体；和偶联在大分子载体外侧的凝集素。本发明专利技术提供的凝集素‑大分子载体偶联复合物可以简便、快速、精准分离临床样本中的糖基化外泌体，分离效率高，重复性好，分离后的外泌体形态完整，无破裂或碎裂，可直接用于糖基化外泌体液体检测，或直接进行免疫学相关检测，或直接提取外泌体内相关核酸进行基因检测分析。

A lectin macromolecular carrier coupling complex for the separation of glycosylated exosomes from clinical samples

【技术实现步骤摘要】
一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物
本专利技术属于生物医药及生物分离相关的
，涉及一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物。
技术介绍
外泌体是细胞多泡内体与质膜融合时释放产生的具有生物活性的微小囊泡，其直径约为30～150nm，是细胞间通讯的重要介质之一；在人健康的生理情况下，外泌体可以在细胞之间运送DNA、蛋白质、mRNA、miRNA等多种生物活性物质，参与细胞通讯、细胞迁移、肿瘤细胞增长等多种过程，完成细胞间物质及信息的传递。文献研究发现，几乎所有类型的细胞均会分泌外泌体，并且在血液、唾液、尿液、脑脊液、积液和乳汁等体液中都能够提取到外泌体。外泌体与肿瘤、慢性感染性疾病、自身免疫病等很多疾病相关，当机体发生病变时，细胞分泌的外泌体的成分、含量、性质等都可能发生改变；糖基化外泌体在包括肿瘤在内的多种疾病的发生、发展过程中均有着重要作用，外泌体的检测研究能有效监测疾病的发生、发展；由于外泌体在样本中含量比较低，外泌体的分离富集对外泌体的研究至关重要。目前，外泌体的分离方法很多，主要有：超速离心法或梯度密度离心法，免疫磁珠法等。其中：超速离心法或梯度密度离心法是基于外泌体与其他生物组份密度的微小差异进行分离，该方法需要特殊设备，样品需求量比较大，耗时长，且因为不同临床样本的特点不同，采用该方法的分离效果稳定性差，进一步地超速离心还容易造成囊泡损伤从而影响后续实验；免疫磁珠法的原理是外泌体表面的特异性蛋白如：CD9/CD63/CD81等与包被有对应抗体的免疫磁珠相结合，进行磁分离，但由于免疫磁珠体积较小，粒径为纳米级别且小于等于外泌体的直径，因此免疫磁珠与外泌体结合的空间位阻较大，外泌体结合不充分，分离效率不高。此外，采用免疫磁珠法分离获得的外泌体因为洗脱时使用酸性洗脱液进行洗脱，导致外泌体形态不完整。因此，一种能用于精准、高效分离富集样本中的糖基化外泌体的组合物、分离装置及分离方法的研究建立是必须的。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物，本专利技术还提供了一种含有该凝集素-大分子载体偶联复合物的糖基化外泌体分离组合物，以及使用该凝集素-大分子载体偶联复合物进行糖基化外泌体分离的方法及应用。本专利技术提供的凝集素-大分子载体偶联复合物可以精准分离临床样本中的糖基化外泌体，分离效率高，分离后的外泌体形态完整，无破裂或碎裂，可直接用于糖基化外泌体液体检测，或直接进行免疫学相关检测，或直接提取外泌体内相关核酸进行基因检测分析。本专利技术提供的糖基化外泌体分离的方法中，利用外泌体外表面丰富的糖链可以和凝集素结合的原理，采用有效地离心清洗及有效地洗脱方法可以分离糖基化外泌体，并且非常简便、快速，重复性好，分离后的外泌体形态完整，无破裂或碎裂，将其应用于疾病的发生、发展等过程中检测、监控及诊断。本专利技术提供了一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物，大分子载体；和偶联在大分子载体外侧的凝集素；其中：所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素、蜗牛凝集素(HAA和/或HPA)中的任意一种或者两种及以上；所述大分子载体包括：葡聚糖微球、琼脂糖微球、树脂或环氧树脂微球、聚苯乙烯微球中的任意一种或者两种及以上。上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述大分子载体粒径分布范围为1μm-200μm，优选为10μm-200μm，更进一步优选为30μm-150μm。上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素-大分子载体偶联复合物中，每1ml大分子载体上偶联有1-20mg，优选为5-15mg，进一步优选为10-15mg凝集素。上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述临床样本包括:血清、血浆、唾液、组织或细胞培养上清液、尿液、脑脊液、淋巴液的任意一种。上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素中的任意一种或者两种及以上。上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述糖基化外泌体包括：N-糖基化外泌体、O-糖基化外泌体、岩藻糖基化外泌体中的任意一种或两种及以上。上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素-大分子载体偶联复合物保存在保存液中，所获得的凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的凝集素-大分子载体偶联复合物的保存浓度(体积比)为10％-60％，优选比例为30％-50％，进一步优选为40％-50％；凝集素-大分子载体偶联复合物保存液的体积是指凝集素-大分子偶联复合物分散在保存液中后，其与保存液的总体积。上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素-大分子载体偶联复合物保存液分装于包括亲和吸附离心管的分离装置中；所述亲和吸附离心管包括：上部离心管和外部保护套管两部分；所述上部离心管的直径小于外部保护套管的直径，所述上部离心管套设于外部保护套管内且在其上部外侧存在凸起的环形边缘或支柱用于支撑上部离心管的开口处高于外部保护套管；所述上部离心管包括离心管盖、离心管壁和与离心管壁固定连接的过滤膜底部，过滤膜底部所使用的过滤膜的孔径小于凝集素-大分子载体偶联复合物的粒径，同时大于外泌体的粒径，所述凝集素-大分子载体偶联复合物保存液保存于上部离心，组成糖基化外泌体的分离装置，过滤膜孔径优选为150nm-1000nm。上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，分装于上部离心管中的凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的凝集素-大分子载体偶联复合物体积占上部离心管体积的1/2-1/4。本专利技术另一方面还提供了一种糖基化外泌体分离组合物，所述糖基化外泌体分离组合物包括：上述凝集素-大分子载体偶联复合物，还包括用于清洗去除分离过程中非特异性结合的、未发生糖基化的外泌体及其他杂质的清洗液和/或用于洗脱特异性结合在凝集素-大分子载体偶联复合物上的糖基化外泌体的洗脱液。这里的组合物并非是指其混合为一体，而是指其同时存在于一个套装中。上述糖基化外泌体分离组合物在某些实施方式中，所述清洗液为无金属盐离子清洗缓冲液或纯化水，可选为无金属盐离子清洗缓冲液，用于清洗去除分离过程中非特异性结合的未发生糖基化的外泌体及其他杂质。上述糖基化外泌体分离组合物在某些实施方式中，所述洗脱液为溶解有糖的硼酸盐缓冲液，可选地为溶有甘露糖的硼酸盐缓冲液，进一步可选地pH值为6.5±0.2，用于洗脱结合在凝集素-大分子载体偶联复合物上的糖基化外泌体，洗脱后的外泌体外观形态完整，无破损或裂解。本专利技术另一方面还提供了一种糖基化外泌体分离方法，包括应用上述的凝集素-大分子载体偶联复合物分离糖基化外泌体的分离步骤，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物，其特征在于，包括：大分子载体；和偶联在大分子载体外侧的凝集素；其中：/n所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素、蜗牛凝集素(HAA和/或HPA)中的任意一种或者两种及以上；/n所述大分子载体包括葡聚糖微球、琼脂糖微球、树脂或环氧树脂微球、聚苯乙烯微球中的任意一种或者两种及以上。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物，其特征在于，包括：大分子载体；和偶联在大分子载体外侧的凝集素；其中：
所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素、蜗牛凝集素(HAA和/或HPA)中的任意一种或者两种及以上；
所述大分子载体包括葡聚糖微球、琼脂糖微球、树脂或环氧树脂微球、聚苯乙烯微球中的任意一种或者两种及以上。


2.根据权利要求1所述的凝集素-大分子载体偶联复合物，其特征在于，所述大分子载体粒径分布范围为1μm-200μm，优选为10μm-200μm，更进一步优选为30μm-150μm。


3.根据权利要求1所述凝集素-大分子载体偶联复合物，其特征在于，所述凝集素-大分子载体偶联复合物中，每1ml大分子载体上偶联有1-20mg，优选为5-15mg，进一步优选为10-15mg凝集素。


4.根据权利要求1所述的凝集素-大分子载体偶联复合物，其特征在于，所述临床样本包括：血清、血浆、唾液、组织或细胞培养上清液、尿液、脑脊液、淋巴液中的任意一种。


5.根据权利要求1所述凝集素-大分子载体偶联复合物，其特征在于，所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素中的任意一种或者两种及以上。


6.根据权利要求1所述的凝集素-大分子载体偶联复合物，其特征在于，所述糖基化外泌体包括：N-糖基化外泌体、O-糖基化外泌体、岩藻糖基化外泌体的任意一种或两种及以上。


7.根据权利要求1所述的凝集素-大分子载体偶联复合物，其特征在于，所述凝集素-大分子载体偶联复合物保存液分装于包括亲和吸附离心管的分离装置中；所述亲和吸附离心管包括：上部离心管和外部保护套管两部分；所述上部离心管的直径小于外部保护套管的直径，所述上部离心管套设于外部保护套管内且在其上部外侧存在凸起的环形边缘或支柱用于支撑上部离心管的开口处高于外部保护套管；所述上部离心管包括离心管盖、离心管壁和与离心管壁固定连接的过滤膜底部，过滤膜底部所使用的过滤膜的孔径小于凝集素-大分子载体偶联复合物的粒径，同时大于外泌体的粒径，所述凝集素-大分子载体偶联复合物保存液保存于上部离心管中；可选地过滤膜孔径为150nm-1000nm。


8.一种糖基化外泌体分离组合物，其特征在于，所述糖基化外泌体分离组合物包括：权利要求1-7之一所述的凝集素-大分子载体偶联复合物，还包括：用于清洗去除分离过程中非特异性结合的、未发生糖基化的外泌体及其他杂质的清洗液和/或用于洗脱特异性结合在凝集素-大分子载体偶联复合物上的糖基化外泌体的洗脱液。


9.根据权利要求8所述的糖基化外泌体分离组合物，其特征在于，所述清洗液为无金属盐离子的清洗缓冲液或纯化水；可选地为无金属盐粒子的清洗缓冲液；
和/或，所述洗脱液为溶有糖的硼酸盐缓冲液，进一步可选地为溶有甘露糖的硼酸盐缓冲液。


10.一种糖基化外泌体分离方法，其特征在于：包括应用权利要求1-7之一所述的凝集素-大分子载体偶联复合物分离糖基化外泌体的分离步骤，所述分离步骤包括：
临床样本前处理：
取前处理后的样本，可选地与清洗液...

【专利技术属性】
技术研发人员：林长青，陈天圣，郝坤，黄鹤，高琦，李艳召，许智慧，郄霜，赵广珍，
申请(专利权)人：北京热景生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11