【技术实现步骤摘要】
一种血浆病毒组学的纳米孔三代测序检测方法
：本专利技术涉及生物
，涉及一种血液病毒的检测方法。
技术介绍
：血液生物安全是重大民生和公共安全问题，血液资源的供应安全保障是国家医疗卫生服务体系正常运行的根本保证。我国存在血液供需矛盾和输血传播疾病风险等日益突出的问题，而常规血液病原体四项筛查HBV、HCV、HIV及TP已不能满足临床用血的安全，目前关于血液病毒谱的研究，血液病毒分布情况国内外研究文献相对较少，因此研究高精度血液病原体特别是血液病毒的检测方法，是目前我国亟待解决的问题，也是世界前沿的发展方向。常规血液病原体四项筛查HBV、HCV、HIV及TP是通过血液酶免的方法或PCR或RT-PCR定量或定性分析病毒核酸确证血液病毒感染的种类，但需要序列特异性抗体或特异性引物才能对病毒抗原或核酸进行检测，由于病毒的变异或低copy样本产生病毒漏检，并且其它可能致病的血液病毒没在常规检测项目内，所以血液病毒宏基因组检测，提取的病毒核酸经过非模板依赖性PCR扩增不仅可以检测已知病毒，而且可以检测未知病毒，大大提高检测灵敏度和特异性。而宏基因组检测的方法主要依赖高通量测序技术的二代和三代测序仪器广泛应用，目前纳米孔测序平台是OxfordNanoporeTechnologies(ONT)公司的MinION纳米孔测序仪，被称为具有发展潜力的第三代测序技术，当下Nanopore纳米微孔技术主要用于培养的细菌、病毒或生物基因组的检测，具有单分子测序，核酸长度可超过150kb，测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等特...
【技术保护点】
1.一种血液病毒的检测方法，该方法用于非诊断目的，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)血液样本病毒富集和建库核酸制备和标准核酸内参加入，(2)纳米孔测序文库构建和验证，(3)文库上机及纳米孔实时测序，(4)生物信息学分析。/n
【技术特征摘要】
1.一种血液病毒的检测方法，该方法用于非诊断目的，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)血液样本病毒富集和建库核酸制备和标准核酸内参加入，(2)纳米孔测序文库构建和验证，(3)文库上机及纳米孔实时测序，(4)生物信息学分析。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
其中，(1)血液样本病毒富集和建库核酸制备及标准核酸内参加入：基于血液待检测样本病毒富集、病毒核酸提取及建库核酸制备及标准核酸内参加入；
其中，(2)纳米孔测序文库构建和验证：用PCR条码试剂盒构建可用于纳米孔测序的核酸库，并验证；
其中，(3)文库上机及纳米孔实时测序：用Nanopore测序试剂盒加入含有混合内参的混合样本库、上机实时检测；
其中，(4)生物信息学分析：首先建立本地的含有300多条Reseq标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用Guppy软件去barcoder分组，用BlastN与本地数据库比，将结果导入MEGAN软件，准确分析血液样本中的病毒组成，标准核酸内参作为评价结果的质控和灵敏度指标。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述血液样本病毒富集和建库核酸制备，包括以下三个步骤：1)、血浆样本病毒富集和宿主游离核酸去除，2)、提取病毒核酸DNA或RNA并合成双链DNA(dsDNA)，3)、病毒核酸纯化和标准内参核酸。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述血液样本病毒富集和建库核酸制备，包括以下三个步骤：1)、血浆样本病毒富集和宿主游离核酸去除：取健康无临床主要症状成人的含有EDTA抗凝剂的全血6-8ml，3000g离心15min，取上清即为血浆，血浆再10000g离心10min，去除细胞碎片后，取上述血浆样本0.5-6ml*，用Hank’s液加到体积为12ml，小心混匀，用SW41转头28800g，4℃离心3h，吸弃上清，加入一定体积的Hank’s液，转移到1.5ml离心管中，用核酸酶消化去除宿主细胞核酸，
2)、提取病毒核酸DNA或RNA并合成双链DNA：主要提取DNA或RNA病毒的核酸包括DNA或RNA，并将病毒RNA转化成更稳定更易保存的cDNA，进一步合成双链DNA，
3)、病毒核酸纯化和标准内参核酸：纯化第二步获得的病毒核酸，每个核酸样本加入100个copy的标准内参核酸，作为整个检测和生物信息分析的质控和灵敏度指标，制备成含标准内参的核酸样本用于后续的建库和测序及生物信息分析。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(2)纳米孔测序文库构建和验证，包括以下步骤：1)、对步骤(1)纯化的病毒核酸准确定量和稀释，2)、DNA修复及末端准备，3)、添加条码、放大并验证，4)、混合样品和DNA文库。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，(2)纳米孔测序文库构建和验证，包括以下步骤：
1)、纯化的病毒核酸准确定量和稀释：用Nanodrop对步骤(1)纯化的病毒核酸检测，满足OD260/280为1.8-1.9及OD260/230为2.2-2.5为符合要求的核酸，用Qubit方法对步骤(1)纯化的病毒核酸进行定量，并稀释到100ng/50ul的核酸浓度，
2)、DNA修复及末端准备：通过NEBNext末端修复/dA尾添加模块进行修复和dA尾添加，并用磁珠纯化S-dsDNA-A.
3)、添加条码、放大并验证：将上述纯化的S-dsDNA-A,用PCR条码试剂盒的12对引物来扩增每个样本，每个样本核酸加barcode接头,即为条码后的S-dsDNA-A-BC，再用磁珠纯化后,条码后的S-dsDNA-A-BC再PCR放大，再用磁珠做分选纯化第三步的S-dsDNA-A-BC，然后用qubit定量，并用Agilent2100跑胶，文库在1k-10k之间，上机测序前稀释成200pg/ul纯化样品，
4)、混合样品和DNA文库：计算混合所需样品量，确保混合后样品摩尔数相等且总量介于10-50fmol之间，根据样品计算结果，混合样品至新的1.5ml离心管中，若混池后的体积大于11μl，使用2X的磁珠进行纯化浓缩，洗脱至11μl，取1μl定量，取混池的DNA样品10μl，加上1μlRAP混匀在室温下5min，冰上放置以备上机测序用S-dsDNA-A-BC-R-Bank。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(3)文库上机及纳米孔实时测序，包括以下步骤：
1)、上机文库的准备：用测序试剂套装，在测序buffer中加上样Beads和带有测序结头核酸混库在一个管子里面一步完成上机文库的全部工作，
2)、Nanopore芯片的准备：先连接测序仪和电脑，打开测序软件，测序芯片是否合格，若合格，进行芯片的清洗试剂的配制和芯片的清洗，以备下面上机用，
3)、上机和时实测序：主要包括第一步的上机文库75μl，完全加到第二步备好的芯片样品孔中，把芯片连接到测序仪上，设置好文件名和测序程序，选择将电测序信号fast5文件时实转换为核酸序列信息fastq文件，实现时实测序，并随时观察样品测序信息和测序孔的使用情况。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(4)生物信息学分析，包括以下步骤：首先建立本地的含有300多条Reseq标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用Guppy软件去barcoder分组，用BlastN与本地数据库比，取比对前5的结果导入MEGAN软件，准确分析血液样本中的病毒组成，标准核酸内参作为评价结果的灵敏度指标。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血液样本病毒富集、核酸提取和建库核酸制备
1)血浆样本病毒富集：取健康无临床主要症状成人的含有EDTA抗凝剂的全血6-8ml，3000g离心15min，取上清即为血浆，血浆再10000g离心10min，去除细胞碎片后，上清0.5-6ml加到超离管中，用Hank’s液加到体积为12ml，小心混匀，用天平配平后，选择W41转头，离心速度为28800g，4℃离心2h，小心移去上清，用Hank’s液加到管底，然后转移到1.5ml离心管中，用核酸酶消化的方法去除宿主细胞核酸，其中核酸酶包括TurboDnase脱氧核糖核酸酶，RNaseone是核糖核酸酶，和Nuclease核酸酶，在37℃消化30min，
2)提取病毒核酸DNA或RNA：用Qiagen公司的QIampviralRNAminiKit提取DNA或RNA病毒的核酸,30μlAVE洗脱，操作按照说明书，用superscriptTMIVFirst-strandsynthesissystem合成cDNA，并用Klenow完成上述cDNA第二链的合成dsDNA，方法按操作说明书，
3)病毒核酸纯化和标准内参核酸：用磁珠纯化第2)步获得的病毒核酸，用25μl无核酸酶水回收，每个核酸样本加入100个copy的标准内参核酸，作为整...
【专利技术属性】
技术研发人员：张婷，杨帆，金奇，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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