具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用技术

本发明专利技术涉及一种采用启动子工程、全局转录机制工程或者二者相结合的方法获得的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。本菌株在高浓度有机溶剂(8％)和底物(15‑45g/L)转化体系中仍保持良好活性，其C

Construction method, strain and application of engineering strain of Arthrobacter simplex with excellent stress tolerance

【技术实现步骤摘要】
具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用
本专利技术属于代谢工程和微生物转化
，尤其是一种具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用。
技术介绍
甾体激素类药物是目前临床上用量仅次于抗生素的第二大类药物，具有抗炎症、抗过敏、抗休克、抗变态反应等功效，此外，甾体激素还具有改善蛋白代谢、恢复和增强体力、利尿降压等作用。甾体化合物的C1,2位脱氢反应是工业上采用微生物转化法生产甾体药物的典型代表，也是生产氢化泼尼松及其同系物最有价值的一种反应。简单节杆菌(Arthrobactersimplex)是目前国内工业上常用的甾体C1,2脱氢反应菌株，具有专一性高、反应速率快等优点。如它对醋酸可的松(CA)表现出高活性，生成的产物醋酸泼尼松(PA)的抗炎活性增大了3～4倍。然而，甾体类化合物较差的水溶性(溶解度一般为10-5-10-6mol/L)限制了底物与胞内生物酶的有效接触，进而限制了催化反应效率。目前为止，添加有机溶剂是工业上甾体生物合成工艺中普遍用来改善底物溶解性的方法。但有机溶剂的用量却因为其对微生物的不利影响受到严格控制，这大大限制了转化体系中底物的投料量，最终影响产率。此外，转化体系中高浓度的底物和产物也会对菌株的活力产生抑制作用，进而影响其转化产率。因此，提高菌株的胁迫耐受性，尤其是有机溶剂耐受性，是创建高效菌株的有效策略。IrrE是来源于耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)R1的一个全局转录因子。研究者发现，该基因导入宿主菌后能对胞内的整个代谢网络产生重要的调控作用，进而改善生物体的各种胁迫耐受性。但大量的研究表明，基因表达水平与复杂目标表型之间存在着非线性的关系。为了获得理想表型，需要对该基因在宿主生物中的表达水平进行精细调控。启动子是一段能够被RNA聚合酶特异性识别并结合从而起始转录的DNA序列，它的结构组成显著影响基因的转录水平。大多数原核生物中，启动子核心区域主要由-10区和-35区组成，这两个保守区域是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。因此，启动子和σ因子之间序列相似性越高，启动子的强度越高。此外，核糖体结合位点与起始密码子之间的距离也是影响基因表达水平的重要因素。目前，研究者主要采取易错PCR或定点突变技术构建启动子文库，从中筛选得到能对基因表达水平进行精细调控的有效表达元件。全局转录机制工程是一种全新的改进细胞表型的定向进化方法，通过易错PCR、DNAshuffling等技术对细胞中的转录元件进行突变修饰，进而改变RNA聚合酶的转录效率和对启动子的亲和能力，使细胞的转录在整体水平上发生改变。因此，该方法在改善由多个基因控制的复杂表型上具有显著的优势。目前尚未发现采用启动子工程、全局转录机制工程或者二者相结合的方法，对irrE基因的表达水平进行精细调控及其定向进化去构建具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，以及利用该工程菌株进行甾体C1,2脱氢反应的报道。通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的公开专利文献。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用，本专利技术通过启动子工程、全局转录机制工程或者二者相结合的方法，对全局转录因子IrrE的表达水平进行精细调控和定向进化，创建具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，为高效简单节杆菌的构建提供一种新策略。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种可适用于简单节杆菌的目标启动子文库，所述目标启动子文库是在表达载体pART2野生型启动子hdnOp的(序列表中的SEQIDNO.2)基础之上，通过随机突变和定点突变技术获得的启动子突变体，其序列为：SEQIDNO.3，和/或为SEQIDNO.4，和/或为SEQIDNO.5，和/或为SEQIDNO.6，和/或为SEQIDNO.7，和/或为SEQIDNO.8，和/或为SEQIDNO.9，和/或为SEQIDNO.10，和/或为SEQIDNO.11，和/或为SEQIDNO.12，和/或为SEQIDNO.13，和/或为SEQIDNO.14，和/或为SEQIDNO.15，和/或为SEQIDNO.16。如上所述的可适用于简单节杆菌的目标启动子文库的构建方法，步骤如下：⑴在质粒pART2上野生型启动子hdnOp5’端引入限制性酶切位点EcoRV，获得重组质粒pART2A，便于后续启动子突变体替换质粒上的野生型启动子；⑵将绿色荧光蛋白EGFP编码基因与pART2A连接构建重组质粒pART2A-EGFP；⑶根据步骤⑴中野生型启动子的序列，设计随机突变引物和定点突变引物；随机突变引物设计的目的是在全启动子区域通过易错PCR引入随机突变，定点突变引物设计的目的是删除原始启动子序列-10区(TATCAAT)的碱基C，或增加核糖体结合位点(SD)到起始密码子(ATG)之间的碱基个数；⑷以步骤⑵中重组质粒pART2A-EGFP为模板，使用步骤⑶中的突变引物PCR扩增得到含有突变位点的启动子核苷酸序列，将其替换质粒pART2A-EGFP上的野生型启动子；或含有突变位点的全质粒，共同组成表达EGFP的启动子突变体质粒库；⑸将步骤⑷中得到的启动子突变体质粒分别转入大肠杆菌E.coliDH5α中，利用流式细胞仪进行流式分选，获得荧光强度前0.1～1％的细胞；将上述获得的细胞涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上培养；⑹挑取步骤⑸中的单菌落于液体LB试管中过夜培养，利用酶标仪检测荧光强度，获得在大肠杆菌中相对于野生型启动子hdnOp具有不同表达强度的启动子突变体；⑺从步骤⑹获得的在大肠杆菌中具有不同表达强度的启动子突变体中，按表达强度筛选出梯度差异的启动子突变体电转入简单节杆菌中，培养至稳定期，利用酶标仪检测荧光强度，获得在简单节杆菌中具有不同表达强度的目标启动子文库。包含如上所述的目标启动子文库的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。而且，所述简单节杆菌工程菌株还包含野生型irrE(W)或irrE(W)突变基因irrE(M2)，所述野生型irrE(W)基因编码的氨基酸序列为：SEQIDNO.1；所述irrE(W)突变基因irrE(M2)编码的氨基酸序列为：SEQIDNO.17。而且，所述irrE(W)突变基因irrE(M2)能够显著提高简单节杆菌的有机溶剂耐受性；或者，所述irrE(W)突变基因irrE(M2)携带四个突变位点，分别为Arg111His，Asp130Asn，Glu182Gly和Ser230Gly。而且，所述irrE(W)突变基因irrE(M2)的构建方法为：⑴以pART2A-irrE(W)质粒为模板，分别在不同浓度的Mg2+、Mn2+、不同模板加入量和不均衡浓度dNTPs的条件下进行反应，建立易错PCR条件；⑵以携带野生型irrE(W)基因的pART2A-irrE(W)质粒为模板进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可适用于简单节杆菌的目标启动子文库，其特征在于：所述目标启动子文库是在表达载体pART2野生型启动子hdnOp的基础之上，通过随机突变和定点突变技术获得的启动子突变体，其序列为：SEQ ID NO.3，和/或为SEQ ID NO.4，和/或为SEQ ID NO.5，和/或为SEQ ID NO.6，和/或为SEQ ID NO.7，和/或为SEQ ID NO.8，和/或为SEQ ID NO.9，和/或为SEQ ID NO.10，和/或为SEQ ID NO.11，和/或为SEQ ID NO.12，和/或为SEQ ID NO.13，和/或为SEQ ID NO.14，和/或为SEQ ID NO.15，和/或为SEQ ID NO.16。/n

【技术特征摘要】
1.一种可适用于简单节杆菌的目标启动子文库，其特征在于：所述目标启动子文库是在表达载体pART2野生型启动子hdnOp的基础之上，通过随机突变和定点突变技术获得的启动子突变体，其序列为：SEQIDNO.3，和/或为SEQIDNO.4，和/或为SEQIDNO.5，和/或为SEQIDNO.6，和/或为SEQIDNO.7，和/或为SEQIDNO.8，和/或为SEQIDNO.9，和/或为SEQIDNO.10，和/或为SEQIDNO.11，和/或为SEQIDNO.12，和/或为SEQIDNO.13，和/或为SEQIDNO.14，和/或为SEQIDNO.15，和/或为SEQIDNO.16。


2.如权利要求1所述的可适用于简单节杆菌的目标启动子文库的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴在质粒pART2上野生型启动子hdnOp5’端引入限制性酶切位点EcoRV，获得重组质粒pART2A，便于后续启动子突变体替换质粒上的野生型启动子；
⑵将绿色荧光蛋白EGFP编码基因与pART2A连接构建重组质粒pART2A-EGFP；
⑶根据步骤⑴中野生型启动子的序列，设计随机突变引物和定点突变引物；随机突变引物设计的目的是在全启动子区域通过易错PCR引入随机突变，定点突变引物设计的目的是删除原始启动子序列-10区的碱基C，或增加核糖体结合位点到起始密码子之间的碱基个数；
⑷以步骤⑵中重组质粒pART2A-EGFP为模板，使用步骤⑶中的突变引物PCR扩增得到含有突变位点的启动子核苷酸序列，将其替换质粒pART2A-EGFP上的野生型启动子；或含有突变位点的全质粒，共同组成表达EGFP的启动子突变体质粒库；
⑸将步骤⑷中得到的启动子突变体质粒分别转入大肠杆菌E.coliDH5α中，利用流式细胞仪进行流式分选，获得荧光强度前0.1～1％的细胞；将上述获得的细胞涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上培养；
⑹挑取步骤⑸中的单菌落于液体LB试管中过夜培养，利用酶标仪检测荧光强度，获得在大肠杆菌中相对于野生型启动子hdnOp具有不同表达强度的启动子突变体；
⑺从步骤⑹获得的在大肠杆菌中具有不同表达强度的启动子突变体中，按表达强度筛选出梯度差异的启动子突变体电转入简单节杆菌中，培养至稳定期，利用酶标仪检测荧光强度，获得在简单节杆菌中具有不同表达强度的目标启动子文库。


3.包含如权利要求1所述的目标启动子文库的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。


4.根据权利要求3所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，其特征在于：所述简单节杆菌工程菌株还包含野生型irrE(W)或irrE(W)突变基因irrE(M2)，所述野生型irrE(W)基因编码的氨基酸序列为：SEQIDNO.1；所述irrE(W)突变基因irrE(M2)编码的氨基酸序列为：SEQIDNO.17。


5.根据权利要求3所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，其特征在于：所述irrE(W)突变基因irrE(M2)能够显著提高简单节杆菌的有机溶剂耐受性；
或者，所述irrE(W)突变基因irrE(M2)携带四个突变位点，分别为Arg111His，Asp130Asn，Glu182Gly和Ser230Gly。


6.根据权利要求3所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，其特征在于：所述irrE(W)突变基因irrE(M2)的构建方法为：
⑴以pART2A-irrE(W)质粒为模板，分别在不同浓度的Mg2+、Mn2+、不同模板加入量和不均衡浓度dNTPs的条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆健美，王敏，朱文成，崔慧林，贾红晨，申雁冰，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12