工程化免疫细胞的制备及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种CD52基因被敲除的工程化免疫细胞的制备及其用途；特别地，本发明专利技术筛选了一种sgRNA分子，可以高特异性地靶向CD52基因，从而提高基因编辑的效率，有利于制备通用型CAR细胞。

Preparation and application of engineered immune cells

【技术实现步骤摘要】
工程化免疫细胞的制备及其用途
本专利技术涉及生物医药
更具体地，涉及一种CD52基因被敲除的工程化免疫细胞的制备及其用途。
技术介绍
嵌合抗原受体(CAR)细胞，尤其是CART细胞是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一，其基本原理主要是提取患者自身的T细胞，并通过基因和细胞工程手段使其表达能够识别并结合肿瘤细胞表面抗原的特异性嵌合抗原受体，从而靶向杀伤肿瘤细胞。CART已经在白血病和淋巴瘤治疗中取得显著的疗效。2017年8月30日，美国FDA批准了CART细胞疗法Kymriah正式上市，用于治疗复发性或难治性儿童、青少年B-细胞急性淋巴细胞白血病（rALL）。急性淋巴细胞白血病在15岁以下儿童癌症确诊病例中约占25%，是美国最常见的儿童癌。在我国，急性淋巴细胞白血病占儿童急性白血病的80%，发病率为十万分之一。另一款批准上市的CART细胞疗法是Yescarta，用于治疗成年特定类型大B细胞淋巴瘤患者。Kymriah和Yescarta都属于自体CART，即从患者身体分离T细胞并进行改造后，再输入该患者。自体CAT作为主流技术有着效果好、免疫不排斥等优点，但其“个性化”的制备使得过程复杂，价格昂贵。通用型CART则可以解决上述问题，因为用采集的健康人的T细胞制备的产品可以用于任何患者输注，但这种同种异体的细胞转移必须避免发生移植物抗宿主病（GvHD）。一般认为GvHD主要是由T细胞表面受体（TCR）的表达引起。然而，单独敲除TCR并不能达到通用型CART细胞的需求，因为CART细胞表面仍然有HLA分子的表达，存在被受体免疫系统T细胞识别后清除的风险。在临床治疗中，通常使用阿伦单抗清除患者体内的T细胞以防止发生排斥反应，但这也导致回输的CART细胞同样面临被清除的风险。而敲除CD52分子的T细胞对阿伦单抗具有抗性，不会被清除，从而达到治疗的目的。CD52是一种糖基磷脂酰肌醇（Glycosyl-phosphati-dylinositol，GPI）锚定糖蛋白，由12个氨基酸残基通过GPI连接于细胞膜表面。它是一种分布比较广泛的抗原，在造血系统中的淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞上都有表达，在很多淋巴系细胞恶性肿瘤和某些急性髓系白血病细胞上也有不同程度的表达。因此，需要一种能有效敲除免疫细胞中CD52基因从而制备通用型CAR细胞的方法，以实现免疫细胞的异体回输。
技术实现思路
目前，CRISPR技术作为一种新的基因组工程化工具，由于其操作简单，靶向精确，已被广泛应用于细胞的基因组编辑和免疫疗法的开发中。最常用的包括II型、V型、VI型等CRISPR系统。以II型CRISPR系统为例，在外源DNA入侵时，来自CRISPR重复阵列的转录物被Cas9和RNaseIII核酸酶加工为成熟的crRNA，随后与tracrRNA和Cas9组成复合体。通过识别PAM，crRNA将该复合体引导至靶标DNA，并通过crRNA包含的间隔区序列与靶DNA的结合，解开DNA双链，再由Cas9中的HNH结构域剪切crRNA的互补DNA链，RuvC结构域剪切非互补链，最终在靶标DNA处引入双链断裂。人们还发现，引导Cas9结合并切割特定的DNA序列不需要RNA复合物。通过使用设计的嵌合单向导RNA（sgRNA）可以简单地实现该过程。术语“单向导RNA”或“sgRNA”是指通过将crRNA和tracrRNA分子融合成“单个向导RNA”的人工工程化RNA，当与Cas9蛋白结合时，其能够识别并切割向导RNA特异性的DNA靶标。sgRNA中负责与靶标DNA互补的是其包含的间隔区序列。sgRNA的设计需要考虑很多因素，例如长度、碱基组成、靶基因的结合位置、与非靶标位点的结合率、是否包含SNP、二级结构等等。目前已经可以通过各种在线工具来设计sgRNA。然而，由于Cas酶可以切割任何邻近PAM位点的靶序列，针对特定的靶基因而言，在线工具设计的大量sgRNA的编辑效率都不尽相同，甚至差异很大，例如，PAM位点是5'-NGG-3'的编辑效率通常就比5'-NGA-3'或5'-NAG-3'的高。因此，筛选特异性高的sgRNA对于CRISPR系统编辑效率的提高至关重要。因此，在第一个方面，本专利技术提供了一种sgRNA分子，其包含的间隔区序列如SEQIDNO：13所示。在第二个方面，本专利技术还提供表达本专利技术所述的sgRNA的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。在第三个方面，本专利技术提供了一种在体外敲除免疫细胞中的CD52基因的方法，包括将该细胞与Cas9酶和sgRNA接触，其中所述sgRNA包含如SEQIDNO：13所示的间隔区序列。在一个实施方案中，所述Cas9酶是蛋白或编码核酸的形式，所述sgRNA是RNA分子、其编码核酸或载体的形式。例如，可以将免疫细胞与Cas9蛋白和sgRNA直接接触，或者将免疫细胞与Cas9蛋白的编码核酸和sgRNA接触，或者将免疫细胞与Cas9蛋白和sgRNA的编码核酸直接接触。在一个实施方案中，所述免疫细胞是例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞等。优选地，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞或NKT细胞，所述T细胞优选CD4+CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞。优选地，所述方法进一步包括向所述免疫细胞中引入编码嵌合抗原受体或T细胞受体或两者的核酸。在一个实施方案中，本专利技术的嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。“配体结合结构域”是指可以与配体结合的任何结构或其功能性变体。配体结合结构域可以是抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其功能性片段。例如，配体结合结构域包括但不限于Fab、Fab'、Fv片段、F(ab')2、单链抗体（SingleChainAntibodyFragment,scFv）、单结构域抗体（SingleDomainAntibody,sdAb）、纳米抗体（Nanobody，Nb）、抗原结合配体、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN等，优选选自Fab、scFv、sdAb和纳米抗体。在本专利技术中，配体结合结构域可以是单价或二价，且可以是单特异性、双特异性或多特异性的抗体。在另一个实施方案中，配体结合结构域也可以是特定蛋白的特异性结合多肽或受体结构，所述特定蛋白是例如PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL和NKG2D。配体结合结构域的选择取决于待识别的与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记，例如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。因此，在一个实施方案中，本专利技术的配体结合结构域与选自以下的一个或多个靶标结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、TnAg、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种sgRNA分子，其包含的间隔区序列如SEQ ID NO：13所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种sgRNA分子，其包含的间隔区序列如SEQIDNO：13所示。


2.一种核酸分子，其编码根据权利要求1所述的sgRNA分子。


3.一种载体，其包含根据权利要求2所述的核酸分子。


4.一种制备工程化免疫细胞的方法，包括将免疫细胞与Cas9酶和根据权利要求1所述的sgRNA接触从而敲除CD52基因。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述Cas9酶是蛋白或编码核酸的形式，所述sgRNA是RNA分子、其编码核酸或载体的形式。


6.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。


7.根据权利要求6所述的方法，进一步包括向所述免疫细胞引入编码嵌合抗原受体或T细胞受体或两者的核酸。


8.根据权利要求7所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述配体结合结构域靶向选自以下的靶标：CD19、CD20、CD22、BAFF-R、CD33、EGFRvIII、BCMA、GPRC5D、PSMA、ROR1、FAP、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、CAIX、WT1、NY-ESO-1、CD79a、CD79b、GPC3、Claudin18.2、NKG2D和它们的任意组合。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述配体结合结构域是靶向CD19、CD22或两者的抗体。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述配体结合结构域包含：（1）抗CD19抗体，其包含与SEQIDNO：26第1-107位或SEQIDNO：28第1-107位所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列和与SEQIDNO：26第123-242位或SEQIDNO：28第123-238位所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列，和/或
（2）抗CD22抗体，其包含与SEQIDNO：30第1-124位所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列和与SEQIDNO：30第143-249位所示的氨基酸序列具有90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列。


11.根据权利要求8所述的方法，其中所述跨膜结构域选自以下蛋白质的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周亚丽，任江涛，贺小宏，王延宾，韩露，
申请(专利权)人：南京北恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32