一种细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞外囊泡—白介素‑10纳米靶向药物及其制备方法和应用，该纳米靶向药物包括源自RAW 264.7巨噬细胞的细胞外囊泡和被包裹在所述细胞外囊泡内作为有效成分的白介素‑10。本发明专利技术的纳米靶向药物通过白介素‑10过表达质粒转染RAW 264.7巨噬细胞，再由地塞米松刺激转染后的巨噬细胞，从细胞培养液中提纯细胞外囊泡得到。本发明专利技术提供的细胞外囊泡—白介素‑10纳米靶向药物可以应用在制备肾脏抗炎药物或制剂中，不仅提高了IL‑10的稳定性，还可使其在肾脏病变部位富集，从而获得良好的靶向抗炎效果，在肾脏病的治疗中具有非常可观的应用前景。

An extracellular vesicle-il-10 nano targeting drug and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物及制备方法和应用。
技术介绍
炎症是多种肾脏病共有的病理现象，以炎症细胞浸润和炎症介质释放为特征，其本质是机体对损伤刺激的防御反应，具有清除感染、修复损伤等作用。但是，紊乱的炎症反应反而会加重肾组织损伤，促进肾脏纤维化。因此，如何防治肾脏炎症一直是肾脏病研究领域的热点及难点。白细胞介素-10(IL-10)最初于1989年发现并报道，具有抗炎、免疫调节等作用。基础研究发现，在多种肾脏病如肾毒血清性肾炎、肾脏缺血再灌注损伤、单侧输尿管梗阻模型中，IL-10均能显著抑制促炎因子的产生和炎症细胞的浸润，提示其在肾脏病抗炎治疗中有着广阔的应用前景。然而，IL-10在循环中极不稳定，且易激活循环中的炎症细胞，影响其疗效，甚至产生致命的毒副作用。所以，IL-10必须通过具有保护作用的运输载体给药于病变肾脏。细胞外囊泡是活细胞分泌的具有双层脂质膜结构的囊泡，根据其产生方式的不同，主要分为三类：外泌体，微囊泡和凋亡小体。研究表明，细胞外囊泡内包含丰富的蛋白、脂质、核酸以及来自于亲代细胞的膜受体，在多种生理和病理过程中发挥着至关重要的作用。近年来发现，细胞外囊泡作为天然稳定的纳米级膜囊泡，能够穿透生物屏障，保护其内容物不被降解，并被受体细胞高效摄取。同时与其他常用的治疗载体如病毒、脂质体等相比，细胞外囊泡还具有低免疫原性、无细胞毒性等优点。显然，细胞外囊泡作为一种新型天然的药物载体为疾病的治疗提供了新的策略。现有研究证实，细胞外囊泡可以作为多种药物的运输载体，如核酸类药物(siRNA、microRNA)，抗炎药物(姜黄素)，抗癌药(多柔比星、紫杉醇)等。然而，目前将IL-10载入细胞外囊泡实现肾脏病抗炎治疗还未有行之有效的方法。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物。本专利技术的纳米靶向药物包括源自RAW264.7巨噬细胞的细胞外囊泡和被包裹在所述细胞外囊泡内作为有效成分的白介素-10，作为靶向药，更利于到达肾脏病变部位，通过抑制炎症因子的表达和炎症细胞的浸润达到改善肾脏炎症的目的。本专利技术还提供所述细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物的制备方法和应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物，包括源自RAW264.7巨噬细胞的细胞外囊泡和被包裹在所述细胞外囊泡内作为有效成分的IL-10。本专利技术所述的细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物的制备方法，包括以下步骤：(1)通过IL-10过表达质粒转染RAW264.7巨噬细胞，得到IL-10表达上调的RAW264.7巨噬细胞；(2)通过地塞米松干预上述转染后的RAW264.7巨噬细胞，进一步刺激IL-10的表达和释放；(3)收集步骤(2)中地塞米松干预后的RAW264.7巨噬细胞的细胞培养液，对细胞外囊泡进行分离提取，提取细胞外囊泡，即得细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物。其中，步骤(1)所述通过IL-10过表达质粒转染RAW264.7巨噬细胞的具体方法为：用含有CMV-MCS-SV40-NeomycinIL-10质粒和Lipofectamine2000的Opti-MEM混合液转染RAW264.7巨噬细胞。进一步地，将RAW264.7巨噬细胞培养于含10％胎牛血清的RIPM1640培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养，当细胞融合达到70％-80％时，用含有CMV-MCS-SV40-NeomycinIL-10质粒和Lipofectamine2000的Opti-MEM混合液转染RAW264.7巨噬细胞8-12小时。作为优选，所述转染1×106个RAW264.7巨噬细胞需要5-8μgCMV-MCS-SV40-NeomycinIL-10质粒和10-15μLLipofectamine2000。更优选地，所述转染1×106个RAW264.7巨噬细胞需要5μgCMV-MCS-SV40-NeomycinIL-10质粒和10μLLipofectamine2000。其中，步骤(2)所述通过地塞米松干预RAW264.7巨噬细胞的具体方法为：用含有200nmol/L地塞米松的RIPM1640培养基干预RAW264.7巨噬细胞36-48小时。优选，干预RAW264.7巨噬细胞48小时。进一步地，当步骤(1)中RAW264.7巨噬细胞转染8-12小时后，用PBS(pH7.4)清洗细胞，并更换为RIPM1640培养基，加入地塞米松使其终浓度为200nmol/L，继续培养RAW264.7巨噬细胞36-48小时。其中，步骤(3)所述细胞外囊泡分离提取的方法为超速离心法，通过2000g离心20分钟，10000离心5分钟，收集上清200000g离心2小时获得沉淀，用无菌PBS重悬清洗，再次200000g离心2小时获得负载IL-10的细胞外囊泡，即为细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物。用无菌PBS(pH7.4)或无菌生理盐水重悬，-80℃保存。本专利技术所述的细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物在制备肾脏抗炎药物或制剂中的应用。进一步地，所述的细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物显著提高了IL-10的稳定性，并使IL-10选择性的在肾脏病变部位释放，通过抑制炎症因子的表达和炎症细胞的浸润在制备达到改善肾脏炎症目的的肾脏抗炎药物或制剂中的应用。本专利技术所述的用于预防和治疗肾脏炎症的药物组合物，其中含有细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物作为活性成分和药学上可接受的载体。作为优选，所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1、将源自RAW264.7巨噬细胞的细胞外囊泡首次作为有效成分IL-10的运输载体，不仅提高了IL-10的稳定性，还可使其在肾脏病变部位富集，从而获得良好的靶向抗炎效果，在肾脏病的治疗中具有非常可观的应用前景。2、本专利技术以源自RAW264.7巨噬细胞的细胞外囊泡作为运输载体，包裹IL-10形成制剂，作为靶向药，更利于到达肾脏病变部位。本专利技术细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物显著提高了IL-10的稳定性，并使IL-10选择性的在肾脏炎症部位释放，通过抑制炎症因子的表达和炎症细胞的浸润达到改善肾脏炎症的目的；同时对其他器官无明显毒副作用。3、本专利技术提供的细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物的制备方法使所述细胞外囊泡良好的包裹了IL-10，为其他基于细胞因子的治疗提供了新的给药策略。4、本专利技术的制备方法简单、方便、高效，RAW264.7细胞数量充足、来源广泛，可以进行规模化生产。附图说明图1为细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物(缩写：IL-10+EVs)的一般鉴定示意图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物，其特征在于，包括源自RAW264.7巨噬细胞的细胞外囊泡和被包裹在所述细胞外囊泡内作为有效成分的IL-10。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物，其特征在于，包括源自RAW264.7巨噬细胞的细胞外囊泡和被包裹在所述细胞外囊泡内作为有效成分的IL-10。


2.一种如权利要求1所述的细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过IL-10过表达质粒转染RAW264.7巨噬细胞，得到IL-10表达上调的RAW264.7巨噬细胞；
(2)通过地塞米松干预转染后的RAW264.7巨噬细胞，进一步刺激IL-10的表达和释放；
(3)收集步骤(2)中地塞米松干预后的RAW264.7巨噬细胞的细胞培养液，对细胞外囊泡进行分离提取，即得细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述通过IL-10过表达质粒转染RAW264.7巨噬细胞的具体方法为：用含有CMV-MCS-SV40-NeomycinIL-10质粒和Lipofectamine2000的Opti-MEM混合液转染RAW264.7巨噬细胞8-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘必成，汤涛涛，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32