喉鳞癌血清外泌体标志物筛选方法和外泌体来源miR-941应用技术

本发明专利技术属于分子诊断和分子生物学技术领域，具体涉及喉鳞癌血清外泌体标志物筛选方法和外泌体来源miR‑941应用。筛选方法是首先通过高通量测序筛选出喉鳞癌患者与健康对照者之间差异表达的血清外泌体miRNAs，选择在喉鳞癌患者中上调表达且表达量高的miRNAs作为候选miRNAs；然后针对候选miRNAs在另一组扩大的样本中进行qRT‑PCR验证，验证之前筛选出用于qRT‑PCR检验的内参基因；最后采用ROC曲线分析目标miRNAs的诊断效能。本发明专利技术还提供了一种喉鳞癌血清外泌体miRNA标志物miR‑941，为喉鳞癌的微创诊断提供新途径，同时可作为潜在药物治疗靶点，具有重大的临床实用价值。

Screening method of serum exosomes markers and application of mir-941 in laryngeal squamous cell carcinoma

【技术实现步骤摘要】
喉鳞癌血清外泌体标志物筛选方法和外泌体来源miR-941应用
本专利技术属于分子诊断和分子生物学
，具体涉及喉鳞癌血清外泌体标志物筛选方法和外泌体来源miR-941应用。
技术介绍
喉鳞状细胞癌(喉鳞癌)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，在包括山西省在内的中国北方地区高发。在过去的40年里，喉鳞癌的发病率在逐渐下降，而5年生存率不升反降，从66％下降到63％。喉鳞癌早期症状不显著，大约60％的患者直到晚期(III或IV期)才被诊断出来。早期诊断方可增加治疗成功的机会，而喉部解剖位置隐蔽，喉癌的早期发现是非常困难的。目前，喉鳞癌的诊断主要依靠内窥镜和病理检查，这是一种侵入性的检测方式，常给患者造成不同程度的痛苦，并且通常需要多次取活检才能确诊。因此，在临床上亟待开发一种快速、微创、高灵敏度的诊断方法及有效可靠的生物学标志物。外泌体是活细胞主动分泌的直径为30-150nm的膜性囊泡，含有母体细胞来源的蛋白质、脂质和核酸，可被释放到人体内包括血液在内的各种体液中。血液是临床上常用的、微创且易于获取的样本，便于动态观察各项指标。血液中的外泌体及内容物可潜在反映其来源亲代细胞的结构和功能，从而映射机体不同的病理生理状态，而不需要对来源细胞直接取样，有作为肿瘤生物学标志物的潜能。MicroRNA(miRNAs)是一种内源性非编码RNA分子，长度在19-22个核苷酸之间，在肿瘤中异常表达，通常作为肿瘤抑制因子或癌基因发挥作用，与肿瘤的发生发展密切相关，是潜在的肿瘤生物学标志物。循环血液中的外泌体miRNAs作为肿瘤标志物，有如下优势：外部有膜的包被，可逃避血液中核酸酶的消化，更为稳定，同时不易受到细胞外环境的影响，研究结果更为可靠；外泌体内miRNAs的成分和丰度与总体血液中相比是有差异的，依赖于母体细胞，更能反映母体细胞的功能状态；外泌体内有些miRNAs是富集的，有利于低丰度miRNAs的检出。
技术实现思路
为了解决现有技术中对于喉鳞癌的诊断仍然需要组织学检查，给患者造成痛苦并且不能及早诊断的缺陷，本专利技术提供了筛选喉鳞癌血清外泌体miRNA标志物的方法。基于这种方法，本专利技术提供了喉鳞癌血清外泌体miRNA标志物，其为Hsa-miR-941(以下简称为miR-941)。喉鳞癌血清外泌体标志物，通过以下步骤制得：(1)收集喉鳞癌患者和健康对照者的血清样本，提取外泌体并进行鉴定，提取外泌体RNA；(2)在小样本量中进行高通量测序，筛选出喉鳞癌患者组与健康对照组间差异表达的血清外泌体miRNAs，选择在喉鳞癌患者中上调表达且表达量高的miRNAs作为候选miRNAs；(3)采用qRT-PCR方法，在扩大的样本中对候选miRNAs进行验证；在验证之前，首先确定qRT-PCR实验的内参基因，筛选过程是：从步骤(2)的RNA测序数据和文献报道中筛选出稳定表达的RNAs作为候选内参基因，经qRT-PCR检测后，再通过5种内参分析算法进行综合分析，筛选出用于qRT-PCR验证的内参基因；(4)ROC曲线评估步骤(3)中验证出的miRNAs的诊断效能，即用于鉴别喉鳞癌患者和健康者的能力。喉鳞癌血清外泌体标志物的筛选方法，包括以下步骤：(1)收集喉鳞癌患者和健康对照者的血清样本，提取外泌体并进行鉴定，提取外泌体RNA；(2)在小样本量中进行高通量测序，筛选出喉鳞癌患者组与健康对照组间差异表达的血清外泌体miRNAs，选择在喉鳞癌患者中上调表达且表达量高的miRNAs作为候选miRNAs；(3)采用qRT-PCR方法，在扩大的样本中对候选miRNAs进行验证；在验证之前，首先确定qRT-PCR实验的内参基因，筛选过程是：从步骤(2)的RNA测序数据和文献报道中筛选出稳定表达的RNAs作为候选内参基因，经qRT-PCR检测后，再通过5种内参分析算法进行综合分析，筛选出用于qRT-PCR验证的内参基因；(4)ROC曲线评估步骤(3)中验证出的miRNAs的诊断效能，即用于鉴别喉鳞癌患者和健康者的能力。喉鳞癌血清外泌体标志物的应用，应用于制备喉鳞癌诊断试剂中。喉鳞癌诊断试剂盒，由血清外泌体、RNA提取试剂、miR-941特异性扩增引物和通用PCR扩增试剂组成；miR-941的正向引物：5’-GCACCCGGCTGTGT-3’。喉鳞癌诊断试剂盒的应用，含有miR-941检测试剂的试剂盒在筛查诊断喉鳞癌中的应用。喉鳞癌药物治疗靶点，所述喉鳞癌药物治疗靶点为miR-941，miR-941的核苷酸序列为：CACCCGGCUGUGUGCACAUGUGC。目前研究认为，肿瘤患者血清外泌体miRNAs主要来源于肿瘤细胞主动分泌，不同于肿瘤细胞死亡后被动释放的游离miRNAs，可真实反映来源母体细胞的功能状态。本专利技术首次采用高通量测序筛选具有潜在诊断价值的喉鳞癌血清外泌体miRNAs，并在另外的扩大样本中进一步验证其表达差异和诊断价值，以达到最优评价体系，以此筛选出的血清外泌体miRNAs生物指标更具有临床指导性，为今后开发诊断喉鳞癌非侵入性生物标志物提供了理论依据，具有重大的临床实用价值。本专利技术基于高通量测序方法，对6例喉鳞癌患者和6例健康对照者的血清外泌体RNA进行测序，获得其miRNA表达谱及差异表达的miRNAs，其后，选择喉鳞癌患者中差异上调表达且表达量高的miRNAs，在另外50例喉鳞癌患者和25例健康对照者中进行qRT-PCR验证，并应用ROC曲线进行诊断效能评估。结果显示，本专利技术提供的血清外泌体miR-941与喉鳞癌密切相关，可用于喉鳞癌的临床诊断及治疗，为临床上相关诊断治疗试剂或芯片等的开发奠定了基础。与现有技术相比本专利技术具有以下优点：本专利技术基于高通量RNA测序分析，结合qRT-PCR方法在大样本中进行验证，并通过ROC曲线分析进行诊断效能评估，筛选出适用于喉鳞癌血清外泌体诊断的标志物，是一种简单有效的筛选方法。本专利技术提供的喉鳞癌血清外泌体miRNA标志物，其在喉鳞癌患者血清外泌体中显著增高，是血清外泌体样本诊断喉鳞癌的非常可靠的标志物，为临床诊断提供了新途径，同时也是潜在的药物治疗靶点。本专利技术提供的试剂盒，使喉鳞癌的临床诊断简便快捷、诊断结果可靠。附图说明图1为血清外泌体特征鉴定。A.透射电镜观察外泌体的形态和大小(Bar＝200nm)；B.NTA检测外泌体的粒径分布；C.免疫印迹法检测外泌体标志蛋白的表达。图2为RNA测序筛选6例喉鳞癌患者和6例健康对照者间血清外泌体差异miRNAs结果。A.差异miRNAs聚类热图；B.差异miRNAs火山图，显示喉鳞癌患者中34个miRNAs上调，41个下调。图3为候选miRNAs在50例喉鳞癌患者和25例健康对照者中的qRT-PCR验证结果，仅显示组间差异有统计学意义的miRNAs，图A和B分别显示miR-941和miR-27a-5p的qRT-PCR检测结果。图4为血清外泌体miRNAs诊断喉鳞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.喉鳞癌血清外泌体标志物，其特征在于：通过以下步骤制得：/n(1)收集喉鳞癌患者和健康对照者的血清样本，提取外泌体并进行鉴定，提取外泌体RNA；/n(2)在小样本量中进行高通量测序，筛选出喉鳞癌患者组与健康对照组间差异表达的血清外泌体miRNAs，选择在喉鳞癌患者中上调表达且表达量高的miRNAs作为候选miRNAs；/n(3)采用qRT-PCR方法，在扩大的样本中对候选miRNAs进行验证；在验证之前，首先确定qRT-PCR实验的内参基因，筛选过程是：从步骤(2)的RNA测序数据和文献报道中筛选出稳定表达的RNAs作为候选内参基因，经qRT-PCR检测后，再通过5种内参分析算法进行综合分析，筛选出用于qRT-PCR验证的内参基因；/n(4)ROC曲线评估步骤(3)中验证出的miRNAs的诊断效能，即用于鉴别喉鳞癌患者和健康者的能力。/n

【技术特征摘要】
1.喉鳞癌血清外泌体标志物，其特征在于：通过以下步骤制得：
(1)收集喉鳞癌患者和健康对照者的血清样本，提取外泌体并进行鉴定，提取外泌体RNA；
(2)在小样本量中进行高通量测序，筛选出喉鳞癌患者组与健康对照组间差异表达的血清外泌体miRNAs，选择在喉鳞癌患者中上调表达且表达量高的miRNAs作为候选miRNAs；
(3)采用qRT-PCR方法，在扩大的样本中对候选miRNAs进行验证；在验证之前，首先确定qRT-PCR实验的内参基因，筛选过程是：从步骤(2)的RNA测序数据和文献报道中筛选出稳定表达的RNAs作为候选内参基因，经qRT-PCR检测后，再通过5种内参分析算法进行综合分析，筛选出用于qRT-PCR验证的内参基因；
(4)ROC曲线评估步骤(3)中验证出的miRNAs的诊断效能，即用于鉴别喉鳞癌患者和健康者的能力。


2.喉鳞癌血清外泌体标志物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)收集喉鳞癌患者和健康对照者的血清样本，提取外泌体并进行鉴定，提取外泌体RNA；
(2)在小样本量中进行高通量测序，筛选出喉鳞癌患者组与健康对照组间差异表达的血清外泌体miRNAs，选择在喉鳞癌患者中上调表达且表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，赵沁丽，吴勇延，王斌全，徐伟，郑希望，薛绪亭，张春明，郭慧娜，刘红亮，
申请(专利权)人：山西医科大学第一医院，
类型：发明
国别省市：山西;14