小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用。本发明专利技术提供了如下蛋白质：将Ppo‑D1蛋白的第299位的甘氨酸替换为精氨酸后得到的蛋白质，和/或将Ppo‑A1蛋白的第251位的脯氨酸替换为亮氨酸后得到的蛋白质，或将其经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同能力的衍生蛋白质，或与其所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或在其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。本发明专利技术获得的M091098和M091507突变体可用于低籽粒PPO活性小麦新品种的选育，为面制品颜色遗传改良提供重要种质资源。

Ppo1 mutant of PPO gene in wheat grain and its application

【技术实现步骤摘要】
小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用。
技术介绍
色泽是小麦面粉及面制品品质评价的重要感官指标(Mares和Campcell，2001；张立平等，2005)。小麦籽粒多酚氧化酶(Polyphenoloxidase，PPO)是造成面粉及其制品颜色褐变的最主要原因(Fuerst等，2006；Morris，2018)，可以解释面粉及面制品加工和储藏过程中50％-70％的色泽褐变(Kruger等，1994；Martin等，2011)。PPO催化酚类物质发生氧化还原反应产生醌类物质或催化多酚类变为氧合醌，后者发生自身非酶促聚合或与蛋白质氨基酸残基或糖类发生反应，产生褐色或黑色的沉积物，从而导致面制品褐变(Jukanti等，2004；Parveen等，2010)。由此可见，PPO不仅影响面制品表观色泽，还影响食品特性及营养价值(Akond等，2010)，因而倍受面粉加工业和育种家关注。培育籽粒低PPO活性小麦品种，降低面粉及其制品的酶促褐变，已成为小麦育种工作的重要目标。小麦籽粒PPO活性受基因型、环境及其互作的影响，其中基因型是最主要决定因素(葛秀秀等，2003)，表明遗传途径降低小麦籽粒PPO活性是可行的。诸多研究结果发现，小麦籽粒PPO活性主要受第二同源染色体上主效基因Ppo1的调控，尤其是Ppo-A1和Ppo-D1(Mares和Campbell，2001；Raman等，2005；张立平等，2005；Sadeque和Turner，2010；Zhai等，2016)。同时，在1A、1B、3B、3D、4A、4B、6B和7A等染色体上也检测到一些微效QTL(Demeke等，2001；张立平等，2005；Sadeque和Turner，2010；Zhai等，2016)。Demeke和Morris(2002)根据物种间PPO蛋白核苷酸序列的保守性，同源克隆获得了第一条普通小麦Ppo基因序列(GenBank登录号AF507945)。Jukanti等(2004)利用该基因序列为探针，筛选GenBank小麦EST数据库，获得其它5个普通小麦Ppo基因，并通过序列同源比对将已有的6条Ppo基因分为两类，一类在籽粒中表达，另一类在其它组织中表达。利用电子克隆和PCR验证相结合的研究策略，He等(2007)克隆获得2A和2D染色体上小麦籽粒Ppo基因的序列全长。随着小麦Ppo基因的不断克隆，其分子功能标记也得到快速开发。Sun等(2005)根据小麦Ppo基因序列(AF507945)开发了一个位于2A染色体上的共显性功能标记PPO18，在具有高、低PPO活性的品种中分别扩增出685bp和876bp的片段。He等(2007)针对Ppo-D1基因的等位变异Ppo-D1a和Ppo-D1b分别开发了互补显性标记PPO16和PPO29，PPO16所扩增的713bp条带与低PPO活性相关，而PPO29扩增的490bp条带与高PPO活性相关。此外，根据Ppo-A1a和Ppo-A1b两等位变异的序列差异，He等(2007)和Wang等(2009)也分别设计了共显性标记PPO33和PPO05；王晓波等(2008)开发了用于检测Ppo-D1位点的显性分子标记STS01。Ppo1基因分子功能标记的开发及应用，有效地加快了低籽粒PPO活性小麦新品种的选育进程。种质资源是育种工作的基础，缺乏突破性低籽粒PPO活性的种质资源，严重影响了低PPO活性小麦新品种的培育和面制品颜色遗传改良。甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulfonate，EMS)诱变仅需要较小的群体便可获得大量的等位变异，且在后代稳定遗传，由于不涉及转基因操作，获得的优异突变体可以直接用于育种实践(侯彩玲等，2008；Slade等，2012)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用。第一方面，本专利技术要求保护一种蛋白质。本专利技术所要求保护的蛋白质，可为蛋白质A或/和蛋白质B。所述蛋白质A可为如下任一：(A1)将Ppo-D1蛋白(具体为Ppo-D1b蛋白)的第299位的甘氨酸替换为精氨酸后得到的(G299R)；(A2)将(A1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同能力的由(A1)衍生的蛋白质；(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。所述蛋白质B可为如下任一：(B1)将Ppo-A1蛋白(具体为Ppo-A1b蛋白)的第251位的脯氨酸替换为亮氨酸后得到的(P251L)；(B2)将(B1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同能力的由(B1)衍生的蛋白质；(B3)与(B1)-(B2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(B4)在(B1)-(B3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。进一步地，所述(A1)所示蛋白质为由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述(B1)所示蛋白质为由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。第二方面，本专利技术要求保护编码前文第一方面所述蛋白质的核酸分子。进一步地，所述核酸分子可为编码前文第一方面所述蛋白质的基因，所述基因可为基因A或/和基因B。所述基因A可为如下任一所示的DNA分子：(a1)SEQIDNo.3所示的DNA分子；(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码前文所述蛋白质A的DNA分子；(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文所述蛋白质A的DNA分子。所述基因B可为如下任一所示的DNA分子：(b1)SEQIDNo.4所示的DNA分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码前文所述蛋白质B的DNA分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文所述蛋白质B的DNA分子。上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质，为蛋白质A或/和蛋白质B；/n所述蛋白质A为如下任一：/n(A1)将Ppo-D1蛋白的第299位的甘氨酸替换为精氨酸后得到的；/n(A2)将(A1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同能力的由(A1)衍生的蛋白质；/n(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；/n(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；/n所述蛋白质B为如下任一：/n(B1)将Ppo-A1蛋白的第251位的脯氨酸替换为亮氨酸后得到的；/n(B2)将(B1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同能力的由(B1)衍生的蛋白质；/n(B3)与(B1)-(B2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；/n(B4)在(B1)-(B3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.蛋白质，为蛋白质A或/和蛋白质B；
所述蛋白质A为如下任一：
(A1)将Ppo-D1蛋白的第299位的甘氨酸替换为精氨酸后得到的；
(A2)将(A1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同能力的由(A1)衍生的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
所述蛋白质B为如下任一：
(B1)将Ppo-A1蛋白的第251位的脯氨酸替换为亮氨酸后得到的；
(B2)将(B1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同能力的由(B1)衍生的蛋白质；
(B3)与(B1)-(B2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(B4)在(B1)-(B3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述(A1)所示蛋白质为由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述(B1)所示蛋白质为由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。


3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。


4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1或2所述蛋白质的基因；所述基因为基因A或/和基因B；
所述基因A为如下任一所示的DNA分子：
(a1)SEQIDNo.3所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1或2中所述蛋白质A的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码权利要求1或2中所述蛋白质A的DNA分子；
所述基因B为如下任一所示的DNA分子：
(b1)SEQIDNo.4所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1或2中所述蛋白质B的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟胜男，刘建军，李豪圣，宋健民，刘爱峰，曹新有，程敦公，赵振东，刘成，郭军，韩冉，訾妍，李法计，汪晓璐，
申请(专利权)人：山东省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37