一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶及其应用。以NADH类似物为辅因子及还原力，催化电子传递，还原细胞色素P450完成催化循环。此酶与不同类型细胞色素P450酶融合表达，构建NADH类似物依赖的、杂合的、自给自足型细胞色素P450酶，获得的NADH类似物依赖细胞色素P450酶可与再生NADH类似物的氧化还原酶偶联，利用NAD类似物催化不同家族细胞色素P450的对应底物转化为产物。该NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶可用于构建生物正交的不依赖天然辅因子NAD(P)H的代谢途径，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。

A NADH analogue dependent cytochrome P450 reductase and its application

【技术实现步骤摘要】
一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶及其应用
本专利技术属于生物
，涉及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)类似物依赖型细胞色素P450还原酶及其应用，具体地说，是经基因工程改造的BMR，以NAD(H)类似物为辅因子及还原力，催化还原细胞色素P450酶，使细胞色素P450酶催化底物转化。将NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶与细胞色素P450酶融合表达构建的NADH类似物依赖的杂合的自给自足型细胞色素P450酶可应用于生物正交代谢途径的构建，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。
技术介绍
细胞色素P450酶是一类功能多样的硫醇盐-亚铁血红素酶蛋白，可选择性活化C-H键、N-H键、S-H键等，从而催化20余种不同类型的反应，实现对大量不同结构底物的选择性羟化、环氧化、脱烷基等修饰性反应，被誉为自然界的“万能催化剂”。但其活性依赖于氧化还原伴侣蛋白将NAD(P)H的两个电子传递到其亚铁血红素辅基上，才能完成其催化循环，实现底物转化为产物。根据细胞色素P450酶电子传递体系，可将其分为五类：(1)ClassI为三组分体系，存在于绝大部分细菌和许多真核生物线粒体中，包括含有FAD的铁氧还蛋白还原酶(FdR)、含有Fe-S簇的铁氧还蛋白(Fdx)和含有亚铁血红素的P450酶三个游离组分，细菌中ClassIP450三个蛋白均可溶，真核生物线粒体中ClassIP450仅Fdx可溶，FdR和P450锚定在膜上。在反应过程中，FdR将电子从NAD(P)H传递到Fdx，Fdx再将电子到P450酶。(2)ClassII为双组分体系，存在于大部分真核微生物内质网膜上，包括含有辅因子FAD和FMN的NAD(P)H细胞色素P450还原酶(NAD(P)HcytochromeP450reductase,CPR)和P450酶，二者均锚定在膜上。在反应过程中，CPR将电子从NAD(P)H传递到P450酶。(3)ClassIII为单组分体系，存在于细菌中，是由含有血红素辅基的P450酶结构域和含有辅因子FAD和FMN的P450还原酶结构域融合而成的一条双功能肽链，在反应过程中，不需要外加辅助的电子传递蛋白，电子在分子内部传递，是一种电子自给自足型催化体系。(4)ClassIV也为单组分体系，具有与ClassI相同的三个组分在一条融合的多肽链上，N-末端的P450功能域与含辅因子FMN的FdR能域相连，在与C-末端含Fe-S簇的Fdx功能域相连，也是一种电子自给自足型催化体系。(5)ClassV为不常见的不依赖于NAD(P)H的P450酶。(BernhardtR.etal.CytochromesP450asversatilebiocatalysts.J.Biotechnol,2006,124,128-145)P450BM3是来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的脂肪酸羟化酶，属于ClassIII类自给自足型P450，是目前文献报道催化效率最高的P450酶，催化效率高达17000min-1，包括含有血红素的P450结构域(BMP)和P450还原酶结构域(BMR)，利用NADPH和O2催化脂肪酸次末端亚甲基羟基化生成羟基脂肪酸(ChristopherJ.C.Whitehouse,etal.P450BM3(CYP102A1):connectingthedots.ChemSocRev,2012,41,1218–1260)。但其他类P450酶生物转化体系仍存在整体效率偏低、依赖还原型辅酶和宿主底物供给能力弱等问题，严重制约其工业化应用。烟酰胺类辅因子(NAD(P))及其还原态NAD(P)H是生命过程中的重要辅酶，参与生命体中的氧化还原代谢及其他一系列重要生物化学过程，任何改变NAD浓度及其氧化还原状态的操作都会对细胞产生全局性影响。而利用NAD类似物和只能识别其的突变型氧化还原酶，可实现在辅酶水平对目标氧化还原过程进行调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义(JiDB,etal.Creationofbioorthogonalredoxsystemsdependingonnicotinamideflucytosinedinucleotide.JAmChemSoc,2011,133,20857-20862；WangL,etal.Syntheticcofactor-linkedmetaboliccircuitsforselectiveenergytransfer.ACSCatal,2017,7,1977-1983)。本研究组报道了几种具有良好生物相容性的NAD类似物。如，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺5-氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD)、烟酰胺5-氯胞嘧啶二核苷酸(NClCD)、烟酰胺5-溴胞嘧啶二核苷酸(NBrCD)和烟酰胺5-甲基胞嘧啶二核苷酸(NMeCD)(JiDB,etal.Creationofbioorthogonalredoxsystemsdependingonnicotinamideflucytosinedinucleotide.JAmChemSoc,2011,133,20857-20862；JiDB,etal.SynthesisofNADanalogstodevelopbioorthogonalredoxsystem.SciChinaChem,2013,56,296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enterococcusfaecalis的NADH氧化酶(NOX，GenbankS45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，GnebankCAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，GenbankP26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，GenbankCAA68326)L6R突变体。目前，已经实现利用NAD类似物进行胞内代谢反应的调控，通过向胞内转运NCD，DLDH-V152R可利用NCD将丙酮酸还原为乳酸，实现了特异性的生物催化调控(WangL,etal.Syntheticcofactor-linkedmetaboliccircuitsforselectiveenergytransfer.ACSCatal,2017,7,1977-1983)。因此构建NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，进而与P450酶融合构建NADH类似物依赖的自给自足型细胞色素P450酶，对实现P450脂肪酸脱羧酶/羟化酶的能量消耗与内源NADPH供给解耦联具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术属于生物
，涉及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物依赖型细胞色素P450还原酶及其应用，具体地说，是经基因工程改造的BMR，以NAD(H)类似物为辅因子及还原力，催化还原细胞色素P450酶，使细胞色素P450酶完成对底物的催化转化，将其与细胞色素P450酶融合表达构建的NADH类似物依赖的杂合的自给自足型细胞色素P450酶可应用于生物正交代谢途径的构建，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。因此，本专利技术的方法可应用在生物催化和生物转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，其特征在于：/n细胞色素P450还原酶来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megatherium的P450 BM3的含黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的P450还原酶结构域BMR，即P450 BM3从第471位到第1048位氨基酸序列，编码基因具有SEQ ID NO：1的基因序列，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列；/nNADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶为在BMR基础上经基因工程改造获得的多位点突变体，突变位点包括但不限于BMR-R967D/K973S、BMR-R967D/K973S/Q977F、BMR-R967D/K973S/Q1005H、BMR-R967D/Q977F/W1047S、BMR-R967D/Q1005H/W1047S、BMR-R967D/K973S/W1047S、BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S中的一种或两种以上。/n

【技术特征摘要】
1.一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，其特征在于：
细胞色素P450还原酶来源于巨大芽孢杆菌Bacillusmegatherium的P450BM3的含黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的P450还原酶结构域BMR，即P450BM3从第471位到第1048位氨基酸序列，编码基因具有SEQIDNO：1的基因序列，具有SEQIDNO：2的氨基酸序列；
NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶为在BMR基础上经基因工程改造获得的多位点突变体，突变位点包括但不限于BMR-R967D/K973S、BMR-R967D/K973S/Q977F、BMR-R967D/K973S/Q1005H、BMR-R967D/Q977F/W1047S、BMR-R967D/Q1005H/W1047S、BMR-R967D/K973S/W1047S、BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S中的一种或两种以上。


2.根据权利要求1所述的NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶，其特征在于：
1)NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶以NADH类似物为辅因子；
2)NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶利用NADH类似物催化还原K3[Fe(CN)6]、细胞色素c；
3)NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶可与不同类型细胞色素P450酶融合构建NADH类似物依赖的自给自足的细胞色素P450酶；
4)NADH类似物依赖的自给自足的细胞色素P450酶的催化过程为：NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶将NADH类似物的两个电子，逐个传递到细胞色素P450酶的血红素催化活性中心，使细胞色素P450酶完成对底物的催化转化。


3.根据权利要求1或2所述NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，其特征在于：NADH类似物为NCDH、NTDH和NUDH中的一种或两种以上，其化学结构如下：





4.根据权利要求3所述的还原酶，其特征在于：NADH类似物NCDH、NTDH或NUDH是由酶法或化学法还原NCD、NTD和NUD而得，NCD、NTD和NUD的化学结构如下：








5.按照权利要求4所述的还原酶，其特征还在于：酶法还原NCD、NTD和NUD的再生酶为包括但不限于苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y中的一种或两种以上；所述再生NAD类似物的氧化还原酶对应再生底物包括但不限于苹果酸化合物，亚磷酸化合物，D-乳酸化合物，甲酸化合物中的一种或两种以上；其中，苹果酸化合物为苹果酸、苹果酸盐中的一种或两种以上；D-乳酸化合物为D-乳酸、D-乳酸盐中的一种或两种以上；亚磷酸化合物为亚磷酸、亚磷酸盐中的一种或两种以上；甲酸化合物为甲酸、甲酸盐中的一种或两种以上；所述酶法再生NADH类似物的反应体系为pH7.5的缓冲液中，NAD类似物1mM-20mM，再生酶10U-500U，再生底物4mM-25mM，20℃-40℃下反应20min-2h，其中缓冲体系包括但不限于磷酸盐、Tris-HCl、MES或HEPES缓冲液中的一种或两种以上。化学法还原NCD，NTD和NUD的反应体系为在水溶液中，以Na...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宗保，李青，刘武军，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21