一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶及其应用。以NADH类似物为辅因子及还原力，催化电子传递，还原细胞色素P450完成催化循环。此酶与不同类型细胞色素P450酶融合表达，构建NADH类似物依赖的、杂合的、自给自足型细胞色素P450酶，获得的NADH类似物依赖细胞色素P450酶可与再生NADH类似物的氧化还原酶偶联，利用NAD类似物催化不同家族细胞色素P450的对应底物转化为产物。该NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶可用于构建生物正交的不依赖天然辅因子NAD(P)H的代谢途径，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。

A NADH analogue dependent cytochrome P450 reductase and its application

【技术实现步骤摘要】
一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶及其应用
本专利技术属于生物
，涉及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)类似物依赖型细胞色素P450还原酶及其应用，具体地说，是经基因工程改造的BMR，以NAD(H)类似物为辅因子及还原力，催化还原细胞色素P450酶，使细胞色素P450酶催化底物转化。将NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶与细胞色素P450酶融合表达构建的NADH类似物依赖的杂合的自给自足型细胞色素P450酶可应用于生物正交代谢途径的构建，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。
技术介绍
细胞色素P450酶是一类功能多样的硫醇盐-亚铁血红素酶蛋白，可选择性活化C-H键、N-H键、S-H键等，从而催化20余种不同类型的反应，实现对大量不同结构底物的选择性羟化、环氧化、脱烷基等修饰性反应，被誉为自然界的“万能催化剂”。但其活性依赖于氧化还原伴侣蛋白将NAD(P)H的两个电子传递到其亚铁血红素辅基上，才能完成其催化循环，实现底物转化为产物。根据细胞色素P450酶电子传递体系，可将其分为五类：(1)ClassI为三本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，其特征在于：/n细胞色素P450还原酶来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megatherium的P450 BM3的含黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的P450还原酶结构域BMR，即P450 BM3从第471位到第1048位氨基酸序列，编码基因具有SEQ ID NO：1的基因序列，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列；/nNADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶为在BMR基础上经基因工程改造获得的多位点突变体，突变位点包括但不限于BMR-R967D/K973S、BMR-R967D/K973S/Q977F、BMR-R967D/K973S...

【技术特征摘要】
1.一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，其特征在于：
细胞色素P450还原酶来源于巨大芽孢杆菌Bacillusmegatherium的P450BM3的含黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的P450还原酶结构域BMR，即P450BM3从第471位到第1048位氨基酸序列，编码基因具有SEQIDNO：1的基因序列，具有SEQIDNO：2的氨基酸序列；
NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶为在BMR基础上经基因工程改造获得的多位点突变体，突变位点包括但不限于BMR-R967D/K973S、BMR-R967D/K973S/Q977F、BMR-R967D/K973S/Q1005H、BMR-R967D/Q977F/W1047S、BMR-R967D/Q1005H/W1047S、BMR-R967D/K973S/W1047S、BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S中的一种或两种以上。


2.根据权利要求1所述的NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶，其特征在于：
1)NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶以NADH类似物为辅因子；
2)NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶利用NADH类似物催化还原K3[Fe(CN)6]、细胞色素c；
3)NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶可与不同类型细胞色素P450酶融合构建NADH类似物依赖的自给自足的细胞色素P450酶；
4)NADH类似物依赖的自给自足的细胞色素P450酶的催化过程为：NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶将NADH类似物的两个电子，逐个传递到细胞色素P450酶的血红素催化活性中心，使细胞色素P450酶完成对底物的催化转化。


3.根据权利要求1或2所述NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，其特征在于：NADH类似物为NCDH、NTDH和NUDH中的一种或两种以上，其化学结构如下：





4.根据权利要求3所述的还原酶，其特征在于：NADH类似物NCDH、NTDH或NUDH是由酶法或化学法还原NCD、NTD和NUD而得，NCD、NTD和NUD的化学结构如下：








5.按照权利要求4所述的还原酶，其特征还在于：酶法还原NCD、NTD和NUD的再生酶为包括但不限于苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y中的一种或两种以上；所述再生NAD类似物的氧化还原酶对应再生底物包括但不限于苹果酸化合物，亚磷酸化合物，D-乳酸化合物，甲酸化合物中的一种或两种以上；其中，苹果酸化合物为苹果酸、苹果酸盐中的一种或两种以上；D-乳酸化合物为D-乳酸、D-乳酸盐中的一种或两种以上；亚磷酸化合物为亚磷酸、亚磷酸盐中的一种或两种以上；甲酸化合物为甲酸、甲酸盐中的一种或两种以上；所述酶法再生NADH类似物的反应体系为pH7.5的缓冲液中，NAD类似物1mM-20mM，再生酶10U-500U，再生底物4mM-25mM，20℃-40℃下反应20min-2h，其中缓冲体系包括但不限于磷酸盐、Tris-HCl、MES或HEPES缓冲液中的一种或两种以上。化学法还原NCD，NTD和NUD的反应体系为在水溶液中，以Na...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宗保，李青，刘武军，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21