一种D-氨基酸基NAD制造技术

本发明专利技术公开了一类基于D‑氨基酸的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD

A D-amino acid nad

【技术实现步骤摘要】
一种D-氨基酸基NAD+类似物及其合成和应用
本专利技术涉及一类NAD+类似物及其合成与应用，属于烟酰胺类辅酶类似物的合成及应用领域。
技术介绍
氧化还原酶需要氧化还原辅因子提供接受或提供电子以及氢质子，氧化还原辅因子主要包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I，NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶II，NADP)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)等。而80％的氧化还原酶都需要NAD(H)作为辅因子，10％的氧化还原酶需要NADP(H)作为辅因子。烟酰胺类辅因子价格非常昂贵，限制了氧化还原酶在工业中的应用。为了降低工业成本，需要用廉价易得的NAD(P)的类似物替代天然辅因子(ChineseJournalofBioprocessEngineering，2004，3，1-8)。所以利用烟酰胺辅因子类似物(mNADs)作为酶的辅因子的研究受到了广泛的关注(ACSCatalysis，2014，4，788-797)。烟酰胺辅因子类似物的结构改变主要有两个方面：一是改变天然辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的腺嘌呤二核苷酸(AD)部分，将烟酰胺1位N的取代基改变为结构简单的基团，比如烷基或芳基，称为合成mNADs；二是保留二核苷酸结构改变吡啶环上3位氨甲酰基为其他酰基基团或改变腺嘌呤基团为其他基团，称为保守mNADs。结构简单的合成mNADs是通过卤代烷烃或卤代芳烃烃将烟酰胺或其类似物在1位N上进行烷基化，得到N取代烟酰胺或其类似物卤化盐(mNAD+s)，然后在碱性条件下用连二亚硫酸钠还原为mNADHs(HelveticaChimicaActa，1937，20，418-423)。保守mNADs，可以利用NAD酶(NADase)催化3-酰基取代的吡啶类似物和天然辅因子(NAD(P))之间的反应，得到只有吡啶环上3位发生改变的保守mNADs(AnalyticalBiochemistry，1991，195，57-62)。也可以用化学合成焦磷酸酯的方法，利用PPh3/(PyS)2在N-甲基咪唑存在情况下活化烟酰胺单核苷酸(NMN)，使其可以与另外一分子腺嘌呤基团经过修饰或改变的单核苷酸快速反应生成焦磷酸酯形式的保守mNADs(ChineseJournalofOrganicChemistry，2014，34，54-64)。结构简单的合成mNADs和结构保守的mNADs都已成功应用于氧化还原酶催化的酶促反应中。Knox研究了硫辛酰胺脱氢酶可利用l-甲基-1，4(2H)-烟酰胺为辅因子催化还原苯甲醌，首次证明简单烟酰胺辅因子类似物可以作为活性辅因子类似物，用于烟酰胺辅因子依赖型的氧化还原酶中(BiochemicalPharmacology，1995，49，1641-1647)。Ryan将细胞色素P450BM-3氧化酶进行突变，并将两种合成烟酰胺类似物1-苯甲基-1，4(2H)-烟酰胺和1-(4-甲氧基苄基)-1，4(2H)-烟酰胺作为突变体与野生型的辅因子催化。发现P450BM-3在1064位的Trp突变为Ser的突变体和966位Arg突变为His的突变体利用利用辅因子类似物的催化效率与野生型利用天然NAD+的效率基本一致(ChemBioChem，2008，9，25792582)。Paul将一系列mNADHs替代烯酮还原酶ERs中天然辅因子NAD(P)H，发现辅因子类似物可以替代天然NAD(P)H，保持催化反应的催化效率和立体选择性(OrganicLetters，2013，15，180-183)。Anderson将3位丁酰基、硫代氨甲酰基或其他基团取代的吡啶化合物与天然NAD+通过NAD酶作用得到的保守mNAD+s，并将所得产物作为单独的辅因子应用到马肝醇脱氢酶中，结果发现吡啶环上3位丁酰基取代的半合成mNAD+s作为马肝醇脱氢酶的辅因子时，酶催化氧化乙醇到乙醛的效率是利用天然NAD+时的8倍，而3位硫代氨甲酰基取代的类似物是其3.5倍(JournalofBiologicalChemistry，1959，234，1219-1225)。本组将烟酰胺辅因子的腺嘌呤部分改变为氟胞嘧啶得到烟酰胺氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD+)，并将其用于苹果酸酶(ME)和D-乳酸脱氢酶(DLDH)的突变体中，发现两种酶的突变体对NFCD+的亲和力及催化活性比对天然NAD+的更大，而野生型对NFCD+的亲和力远小于NAD+(JournaloftheAmericanChemicalSociety，2011，133，20857-20862)。已报道的NAD+类似物能够用作氧化还原酶的辅酶，但不能被酶特异性的识别，需要对酶进行突变后，才能特异性识别，提高酶反应速率。所以设计不同结构廉价易得的NAD+类似物，再对酶进行定向进化，使酶能有效识别NAD+类似物，降低生产成本。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于设计合成一类NAD类似物，使其能有效的被氧化还原酶识别，作为氧化还原酶的辅酶，催化氧化还原反应。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种D-氨基酸基NAD+类似物，其特征在于：D-氨基酸基NAD+类似物的结构式如下：其中，以氨基酸羧基为1位碳，类似物2位碳原子手性中心的立体构型为R，取代基R为C1-C5的烷基或C1-C5中的H被-OH、-COOH、-CONH2、-SCH3、中的一种或二种以上取代的烷基，取代位置为烷基远离1位碳的末端或次末端(从末端数第二个碳)碳原子上。所述的D-氨基酸基NAD+类似物包括但不限于以下化合物中的一种或二种以上：D-氨基酸基NAD+类似物的合成方法，其特征在于：D-氨基酸基NAD+类似物是以1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐和D--氨基酸为原料，在碱催化下合成的。所述合成D-氨基酸基NAD+类似物的原料D--氨基酸包括但不限于以下结构中的一种或二种以上：所述的碱为乙酸钠、甲酸钠、三乙胺、三丙胺或三丁胺中的一种或两种以上；1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐、D--氨基酸和碱三者的摩尔当量比为1∶1～1.1∶1～2；反应温度为20～40；合成NAD+类似物的溶剂为甲醇、水、或甲醇与水任意体积比例的混合物。所述的D-氨基酸基NAD+类似物可作为NAD(P)依赖型氧化还原酶的辅酶，用于催化相应底物转化为产物。所述的氧化还原酶包括但不限于苹果酸酶、亚磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、甲醇脱氢酶、1，3-丙二醇脱氢酶中的一种或两种以上：其中对应的底物包括但不限于苹果酸及苹果酸盐、亚磷酸及亚磷酸盐、乳酸及乳酸盐、甲酸及甲酸盐、甲醛、甲醇、1，3-丙二醇中的一种或两种以上。利用D-氨基酸基NAD+类似物为辅因子，以一种NAD(P)依赖型氧化还原酶为生产酶，偶联另一种NAD(P)依赖型氧化还原酶为再生酶，可实现D-氨基酸基NAD+类似物的再生循环。本专利技术中NAD+类似物的编号为D-Xyz-NAD，其中D为氨基酸立体构型，Xyz为氨基酸的三字母简写；本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种D-氨基酸基NAD

【技术特征摘要】
1.一种D-氨基酸基NAD+类似物，其特征在于：D-氨基酸基NAD+类似物的结构式如下：



其中，以氨基酸羧基为1位碳，类似物2位碳原子手性中心的立体构型为R，取代基R为C1-C5的烷基或C1-C5中的H被-OH、-COOH、-CONH2、-SCH3、中的一种或二种以上取代的烷基，取代位置为烷基远离1位碳的末端或次末端(从末端数第二个碳)碳原子上。


2.根据权利要求1所述的D-氨基酸基NAD+类似物，其特征在于：类似物包括但不限于以下化合物中的一种或二种以上：





3.一种权利要求1或2所述的D-氨基酸基NAD+类似物的合成方法，其特征在于：D-氨基酸基NAD+类似物是以1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐和D-α-氨基酸为原料，在碱催化下合成的。


4.根据权利要求3所述的D-氨基酸基NAD+类似物的合成方法，其特征在于：所述合成D-氨基酸基NAD+类似物的原料D-α-氨基酸包括但不限于以下结构中的一种或二种以上：


5.根据权利要求3或4所述的D-氨基酸基NAD+类似物的合成方法，其特征在于：所述的碱为乙酸钠、...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宗保，李青，刘武军，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21