一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法技术

本发明专利技术涉及生物医学工程领域，公开了一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法，包括：切取周围神经，剔除其外脂肪、血管及结缔组织，然后清洗；将清洗后的周围神经浸入表面活性剂溶液中，并置于高温高压反应釜中，通入CO

Preparation of acellular nerve graft by supercritical fluid extraction

【技术实现步骤摘要】
一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法
本专利技术涉及生物医学工程领域，尤其涉及一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法。
技术介绍
周围神经缺损是指外伤或手术导致的周围神经干离断，是临床常见病症。神经缺损分为四度，其中Ⅰ、Ⅱ度缺损可以通过改变关节位置或者通过病理方法如游离神经干，前置、改道、延长或缩短骨关节而克服，而Ⅲ度以上(或缺损距离大于缺损神经直径4倍以上)的缺损则必须依靠神经移植或各种代用品桥接才能修复。到目前为止疗效最为确切的神经移植是自体神经移植，就是把患者自身相对不重要的神经移植到缺损部位，目前仍作为评价各种神经移植物效用的“金标准”，但可供移植的神经存在来源有限、组织结构和尺寸难匹配、移植供区长期失神经支配、移植疗效存在差异等不足，这些不足限制了自体神经移植的广泛开展。而同种异体神经移植由于需长期应用免疫抑制剂，移植成功率低，应用也受到限制。但异体(种)神经用作支架材料有其优点：具有神经内膜管结构，还含有能促进神经生长的物质(如层粘连蛋白)，有利于引导和容纳神经轴突生长和通过。去细胞技术的应用拓宽了同种异体神经移植领域的应用，去除异体神经中的活细胞，可以大大减小其抗原性，而基底膜管保存完好，可作为神经组织工程的支架材料。1998年，瑞典Lund大学的Sondell等应用脱氧胆酸钠和聚乙二醇叔辛基苯基醚(TritonX-100)制备大鼠去细胞神经，不仅清除雪旺细胞等所有细胞成分，还保持了雪旺细胞基底板层的管状结构完整，制备步骤为：(1)蒸馏水中振荡浸浴12h；(2)3％TritonX-100溶液中振荡萃取12h；(3)4％脱氧胆酸钠溶液中振荡萃取24h；(4)视神经直径大小重复上述步骤2-4次；(5)蒸馏水冲洗30min。该方法中所用萃取剂为TritonX-100和脱氧胆酸钠。TritonX-100是一种常用的非离子型的表面活性剂和乳化剂，它被视为一种不变性的相对温和的洗涤剂，经常用于生化应用以溶解蛋白质。他的作用是用于裂解细胞以提取蛋白和细胞器。但其对于粗大和致密的组织，其脱细胞作用不彻底。而脱氧胆酸钠主要作用有：裂解细胞、溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白，如膜蛋白等；因此脱氧胆酸钠去细胞彻底，但对神经的结构的破坏也大。另外该方法反应时间长：单次反应一般需要24小时，同时需要3-5次才能够将细胞脱干净。总之，目前普遍采用的化学脱细胞体系存在的缺点：1、化学脱细胞反应液浓度和反应能力强；2、化学脱细胞反应时间太长，反应次数太多；3、由于水体系穿透力差，蛋白质祛除不够彻底，残留值高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法，本专利技术方法大大减少了脱细胞化学试剂的用量和浓度，同时所需反应温度低、作用时间短、反应次数少，对神经的结构破坏很小。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法，包括以下步骤：1)切取周围神经，剔除所述周围神经的外脂肪、血管及结缔组织后，在蒸馏水中振荡浸浴12h；2)将步骤1)处理得到的周围神经浸入含有表面活性剂的溶液中，并置于高压反应釜中，通入CO2排出所述高压反应釜内空气，然后在温度为25～35℃、压力为15～25Mpa的条件下进行反应以去除所述周围神经的蛋白质，反应结束后，打开所述高压反应釜，取出去除蛋白质的周围神经，所述表面活性剂为TritonX-100或TritonX-200；3)将步骤2)得到的去除蛋白质的周围神经用十二烷基硫酸钠溶液清洗3h，然后用蒸馏水浸泡，得脱细胞神经移植物。优选的，本专利技术所提供的方法中，步骤2)中所述表面活性剂为TritonX-200。优选的，本专利技术所提供的方法中，步骤2)中含有表面活性剂的溶液中表面活性剂的含量为1～3wt％。优选的，本专利技术所提供的方法中，步骤2)中所述反应时间为0.5～3h。优选的，本专利技术所提供的方法中，步骤3)中所述十二烷基硫酸钠溶液的质量浓度为1％。优选的，本专利技术所提供的方法中，步骤3)所述浸泡具体为：用蒸馏水将十二烷基硫酸钠溶液清洗后的周围神经浸泡，每隔20min更换一次蒸馏水，浸泡三次。与现有技术相比，本专利技术利用超临界二氧化碳作为反应体系，只使用温和的聚乙二醇叔辛基苯基醚(TritonX-100)或更为温和更适用于神经组织的TritonX-200溶解蛋白质，彻底去除掉有免疫原性的蛋白质。使用的超临界流体具有类似气体的较强穿透力和类似于液体的较大密度和溶解度，大大减少了脱细胞过程中化学试剂的用量和浓度、同时反应温度低、作用时间短和反应次数少，可有效降低免疫原性，而且对神经的结构破坏很小，不但保持了雪旺细胞基底板层的管状结构完整，神经基底膜管完整、通畅，还保留了在轴突再生中至关重要的板层素。具有很好的临床使用效果，值得临床推广。具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本专利技术的特征和优点，而不是对本专利技术权利要求的限制。本专利技术所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。本专利技术提供了一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法，包括以下步骤：1)切取周围神经，剔除所述周围神经的外脂肪、血管及结缔组织后，在蒸馏水中振荡浸浴12h；2)将步骤1)处理得到的周围神经浸入含有表面活性剂的溶液中，并置于高压反应釜中，通入CO2排出所述高压反应釜内空气，然后在温度为25～35℃、压力为15～25Mpa的条件下进行反应以去除所述周围神经的蛋白质，反应结束后，打开所述高压反应釜，取出去除蛋白质的周围神经，所述表面活性剂为TritonX-100或TritonX-200；3)将步骤2)得到的去除蛋白质的周围神经用十二烷基硫酸钠溶液清洗3h，然后用蒸馏水浸泡，得脱细胞神经移植物。具体的，本专利技术首先切取哺乳动物(如老鼠、犬)的周围神经(如坐骨神经)，切成一定长度，剔除该周围神经外脂肪、血管及结缔组织，然后放入蒸馏水中振荡浸浴12h。清洗结束后，本专利技术将清洗后的周围神经浸入表面活性剂溶液中，并置于高压反应釜中，通入CO2排出反应釜内空气，然后在温度为25～35℃、压力为15～25Mpa的条件下进行反应以去除所述周围神经的蛋白质，反应结束后，打开高压反应釜，取出去除蛋白质的周围神经。超临界流体萃取是目前最先进的物理萃取技术，简称SFE(supercriticalfluidextraction)。在较低温度下，不断增加气体的压力时，气体会转化成液体，当压力增高时，液体的体积增大，对于某一特定的物质而言总存在一个临界温度(Tc)和临界压力(Pc)，高于临界温度和临界压力，物质不会成为液体或气体，这一点就是临界点。在临界点以上的范围内，物质状态处于气体和液体之间，这个范围之内的流体成为超临界流体(SF)。超临界流体具有类似气体的较强穿透力和类似于液体的较大密度和溶解度，具有良好的溶剂特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)切取周围神经，剔除所述周围神经的外脂肪、血管及结缔组织后，在蒸馏水中振荡浸浴12h；/n2)将步骤1)处理得到的周围神经浸入含有表面活性剂的溶液中，并置于高压反应釜中，通入CO

【技术特征摘要】
1.一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)切取周围神经，剔除所述周围神经的外脂肪、血管及结缔组织后，在蒸馏水中振荡浸浴12h；
2)将步骤1)处理得到的周围神经浸入含有表面活性剂的溶液中，并置于高压反应釜中，通入CO2排出所述高压反应釜内空气，然后在温度为25～35℃、压力为15～25Mpa的条件下进行反应以去除所述周围神经的蛋白质，反应结束后，打开所述高压反应釜，取出去除蛋白质的周围神经，所述表面活性剂为TritonX-100或TritonX-200；
3)将步骤2)得到的去除蛋白质的周围神经用十二烷基硫酸钠溶液清洗3h，然后用蒸馏水浸泡，得脱细胞神经移植物。
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨宇民，赵亚红，张鲁中，李贵才，凌珏，杨鹏翔，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32