一种iPS来源心肌细胞复合补片及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种iPS来源心肌细胞复合补片，此心肌补片由天然高分子材料的基底膜，以及附着于基底膜一侧或二侧表面上的由iPS细胞分化产生的心肌细胞层所构成，具有与心肌组织相似的组成、结构及功能。本发明专利技术还提供上述iPS来源心肌细胞复合补片的制备方法。本发明专利技术操作简单，成本低，所制备的复合补片生物活性高，强度好，可贴附在心脏受损部位，促进受损心肌组织的修复。本发明专利技术克服了已有技术的缺陷，在再生医学领域中将发挥重要作用。

A composite patch of IPS derived cardiomyocytes and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种iPS来源心肌细胞复合补片及其制备和应用
本专利技术涉及再生医学领域，特别涉及一种iPS来源心肌细胞复合补片及其制备和应用。
技术介绍
现有的溶栓药物与介入手术疗法尽管可以改善心肌梗死患者的症状，但却无法逆转坏死心肌。对于严重的心肌梗死患者，器官移植是根本治疗手段，但由于移植供体的缺乏与免疫排斥问题，严重限制了器官移植的开展。尽管一些临床研究证实常规细胞注射方法能够改善患者心功能，但是存在细胞存留量少、细胞活率低以及心律失常等问题。心肌补片是通过组织工程手段制备的片状的工程化心脏组织，它具有细胞片层结构，能够提高植入后细胞的存留量和存活率，因此越来越受到重视。不同的构建方法可以制备不同特点的心肌补片，其功能和特性也各不相同，对治疗效果有很大影响。目前研究比较广泛的是日本TeruoOkano团队专利技术的无载体细胞片层制备方法，即利用温敏材料聚异丙基丙烯酰胺在37℃呈疏水性，在20℃时材料转变为亲水性这一原理，将温敏材料铺在培养皿底部并在其上种植种子细胞，细胞经一段时间培养并建立好细胞间连接后，通过降低温度(20℃)使得细胞片逐渐与培养皿底部分离。然而他们所制备的细胞片层是依靠细胞之间的连接构成的，培养时间长，且细胞层厚度受限，力学强度低，因此移植前的培养时间较长，移植时细胞片层缺乏支撑，操作困难。与无载体细胞片层相比，有载体细胞片层是使用支架材料作为补片的基底层，一方面可显著提高细胞片层的厚度和力学强度，增加移植手术的可操作性，另一方面支架材料的特性可以影响心肌组织微环境及细胞片层的活性和功能。目前心肌补片基底层主要包括聚丙烯晴、聚己内酯等人造高分子基底层，以及胶原、壳聚糖、蚕丝蛋白等一种或两种天然高分子所构建的基底层，其成分、结构及功能与体内细胞外基质差距很大，缺乏足够的生物活性。另外，目前心肌补片以成熟的心肌单细胞层为主，尚未形成微组织，缺乏足够的生物学功能，治疗效果很有限。iPS细胞具有全能性，在近似在体培养环境中经过诱导分化能够形成具有搏动能力的心肌微组织层，其功能明显好于心肌单细胞层。为了改善现有心肌补片基底层与体内细胞外基质相差较大以及心肌单细胞层生物功能低的问题，本专利技术将仿生基底和iPS相结合，提出了一种新型的iPS来源心肌细胞复合补片及其制备方法。本专利技术提出的心肌补片由仿细胞外基质的基底膜以及基底膜上的经iPS细胞分化产生的心肌微组织层所构成，具有更高的生物学活性和更好的力学强度，且植入操作更方便，能够显著提高治疗效果。因此，本专利技术克服了已有技术的缺陷，在心肌修复领域中将发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术公开了一种iPS来源心肌细胞复合补片，此心肌补片由天然高分子材料的基底膜，以及附着于基底膜一侧或二侧表面上的由iPS细胞分化产生的心肌细胞层所构成，具有与心肌组织相似的组成、结构及功能。基底膜制备：配制含有壳聚糖、透明质酸及明胶的成胶水溶液，之后加入交联剂进行交联反应，获得凝胶膜，再经过中和、清洗及干燥后即得到基底膜；所述壳聚糖在成胶水溶液中的浓度为1-10％(w/v,g/ml)，优选浓度为5％(w/v,g/ml)；所述透明质酸在成胶水溶液中的浓度为0.1-1％(w/v,g/ml)，优选浓度为0.5％(w/v,g/ml)；所述明胶在成胶水溶液中的浓度为3-15％(w/v，g/ml)，优选浓度为10％(w/v，g/ml)；所述交联剂与成胶水溶液混合后的交联剂浓度为0.01-3％(w/v,g/ml)，优选浓度为0.5％(w/v,g/ml)。所述壳聚糖的分子量为30000-200000kDa，优选分子量为110000；所述透明质酸的分子量为1300000-3000000kDa，优选分子量为2000000kDa；所述明胶包括碱性明胶、酸性明胶的一种或两种混合；所述明胶的胶冻强度为大于100Bloomg；所述交联剂为甲醛、戊二醛、京尼平、碳二亚胺的一种。所述交联条件为温度18-25℃，交联过程时间大于等于60分钟；所述中和过程为使用0.05-0.3M甘氨酸溶液浸泡交联形成的凝胶膜，优选浓度为0.1M，中和过程时间大于等于10分钟。所述干燥的条件为温度18-25℃，湿度20-40％。将iPS细胞依次用ActivinA及BMP4进行预处理；将ActivinA及BMP4预处理后的细胞接种在用水浸润后的基底膜上，并进行无血清诱导分化1-3周，优选2周，获得具有搏动能力的复合补片。所述ActivinA预处理为使用含有50-200ng/mlActivinA(优选浓度为100ng/ml)及质量浓度1-3％B27(不含胰岛素，优选质量浓度为2％)的RPMI1640培养液处理iPS细胞12-36h，优选处理时间为24h。所述BMP4预处理指在ActivinA预处理之后再使用含有5-20ng/mlBMP4(优选浓度为10ng/ml)及质量浓度1-3％B27(不含胰岛素，优选质量浓度为2％)的RPMI1640培养液处理细胞2-6天，优选处理时间为4天。所述将ActivinA及BMP4预处理后的细胞消化，之后接种在用水浸润后的基底膜上，细胞接种密度为2-10×104/cm2，优选5×104/cm2；所述无血清诱导分化指使用含有质量浓度1-3％B27(不含胰岛素，优选质量浓度为2％)的RPMI1640培养液培养细胞。所述iPS来源心肌细胞复合补片作为修复心肌损伤移植物的应用。此心肌补片具有与心肌组织相似的组成、结构及功能，将iPS来源心肌细胞复合补片贴附于受损心肌组织表面，其即可修复心肌损伤。本专利技术的优点1.体内细胞外基质由蛋白、多糖等活性物质构成，本专利技术利用多种天然高分子材料制备了与体内细胞外基质组成及结构相近的仿生基底膜，显著提高了基底膜的生物活性，为细胞层提供了更好的生长微环境，并有利于与宿主心肌组织的融合，同时还显著提高了补片的力学强度和韧性，有利于植入操作；2.本专利技术在仿生基底膜上制备iPS细胞分化产生的心肌微组织层，使得补片形成了功能性心肌微组织，其生物活性比常规单层心肌细胞更高，体内促心肌修复效果更好。具体实施方式实施例1：制备含有1％(w/v,g/ml)壳聚糖(30000kDa)、0.1％(w/v,g/ml)透明质酸(1300000kDa)及3％(w/v,g/ml)明胶(220Bloomg)的成胶水溶液，之后加入交联剂京尼平进行交联反应，交联剂终浓度为0.01％(w/v,g/ml)，交联条件为温度25℃，湿度50％，交联过程时间为60分钟，获得凝胶膜，再经过0.05M甘氨酸溶液中和10分钟，清洗及干燥(18℃，湿度20％)后即得到仿细胞外基质基底膜。将人血液单个核细胞来源的iPS细胞按照105细胞/cm2的密度接种于培养皿中并使用mTeSRTM1培养液培养，当细胞达到90％融合时替换为含有50ng/mlActivinA及1％B27(不含胰岛素，GibcoTMB-27TMSupplement,minusins本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种iPS来源心肌细胞复合补片，其特征在于：/n由天然高分子材料的基底膜，以及附着于基底膜一侧或二侧表面上的由iPS细胞分化产生的心肌细胞层所构成。/n

【技术特征摘要】
1.一种iPS来源心肌细胞复合补片，其特征在于：
由天然高分子材料的基底膜，以及附着于基底膜一侧或二侧表面上的由iPS细胞分化产生的心肌细胞层所构成。


2.按照权利要求1所述的复合补片，其特征在于：
基底膜制备：配制含有壳聚糖、透明质酸及明胶的成胶水溶液，之后加入交联剂进行交联反应，获得凝胶膜，再经过中和、清洗及干燥后即得到基底膜；
所述壳聚糖在成胶水溶液中的浓度为1-10％(w/v,g/ml)，优选浓度为5％(w/v,g/ml)；
所述透明质酸在成胶水溶液中的浓度为0.1-1％(w/v,g/ml)，优选浓度为0.5％(w/v,g/ml)；
所述明胶在成胶水溶液中的浓度为3-15％(w/v，g/ml)，优选浓度为10％(w/v，g/ml)；
所述交联剂与成胶水溶液混合后的交联剂浓度为0.01-3％(w/v,g/ml)，优选浓度为0.5％(w/v,g/ml)。


3.按照权利要求2所述的复合补片，其特征在于：
所述壳聚糖的分子量为30000-200000kDa，优选分子量为110000；
所述透明质酸的分子量为1300000-3000000kDa，优选分子量为2000000kDa；
所述明胶包括碱性明胶、酸性明胶的一种或两种混合；所述明胶的胶冻强度为大于100Bloomg；
所述交联剂为甲醛、戊二醛、京尼平、碳二亚胺的一种。


4.按照权利要求1所述的复合补片，其特征在于：
所述交联条件为温度18-25℃，交联过程时间大于等于60分钟；
所述中和过程为使用0.05-0.3M甘氨酸溶液浸泡交联形成的凝胶膜，优选浓度为0.1M，中和过程时间大于等于10分钟；所述干燥的条件为温度18-25℃，湿度20-40％。

【专利技术属性】
技术研发人员：孙广炜，刘洋，张英，赵姗，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21