白介素-2多肽偶联物及其用途制造技术

本发明专利技术提供了通过使用与影响表达白介素‑2受体的细胞的生物活性分子相偶联的白介素‑2(IL‑2)变体来靶向表达所述白介素‑2受体的细胞并特别是抑制此类细胞的生长的方法。

Interleukin-2 peptide conjugate and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】白介素-2多肽偶联物及其用途申请人：Ambrx,Inc.10975NorthTorreyPinesRoad,Suite100LaJolla,California92037专利技术人：陈思耕，美国公民，10704BallystockCourt,SanDiego,CA92131卢迎春，美国公民，6291SunroseCrestWay,SanDiego,CA92130哈努尔·拉希德，美国公民，9525GeneseeAve.,Apt.213,SanDiego,CA92121尼克拉斯·克努森，美国公民，1916RohnRoad,Escondido,CA92025田丰，美国公民，8374OrangeHavenPlace,SanDiego,CA92129白介素-2多肽偶联物及其用途对相关申请的引用本申请要求分别在2018年9月11日和2019年3月8日提交的各自题为“白介素-2多肽偶联物及其用途”(Interleukin-2PolypeptideConjugatesandTheirUses)的美国临时申请号62/729,925和62/815,964的权益，每个所述临时申请的内容整体通过引用并入本文。序列表本申请含有通过EFS-Web以ASCII格式提交并整体通过引用并入本文的序列表。所述ASCII拷贝在2019年9月11日产生，名为AMBX_0227_PCT_ST25.txt，并且大小为27,729字节。
本专利技术提供了通过使用白介素-2(IL-2)变体来调节白介素-2的生物活性以及特别是调节特异性受体相互作用的方法，所述IL-2变体在所述IL-2蛋白的氨基酸序列中与白介素-2受体相互作用的位置处偶联到聚合物。
技术介绍
癌症是最重要的健康病症之一。在美国，癌症具有仅次于心脏病的第二大死亡率，占死亡人数的四分之一。人们普遍预计，癌症的发病率将随着美国人口的老龄化而增加，进一步加剧这种病症的影响。在1970年代和1980年代确立的当前用于癌症的治疗方案尚未发生太大变化。当在大多数晚期常见癌症中使用时，包括化疗、辐射和其他方式(包括较新的靶向疗法)在内的这些治疗显示出有限的总体生存获益，因为这些疗法主要靶向肿瘤块。更具体来说，迄今为止，常规的癌症诊断和疗法试图选择性地检测并根除主要是快速生长的赘生性细胞(即形成肿瘤块的细胞)。标准的肿瘤学治疗方案通常主要被设计成给药没有过度的毒性的最高剂量的辐射或化学治疗剂，即通常被称为“最大耐受剂量”(MTD)或“未观察到不良反应的水平”(NOAEL)。许多常规癌症化疗(例如烷基化药剂如环磷酰胺、抗代谢药如5-氟尿嘧啶和植物生物碱如长春新碱)和常规放疗主要通过干扰参与细胞生长和DNA复制的细胞机制来发挥它们对癌细胞的毒性效应。化疗方案通常还包括给药化学治疗剂的组合以试图提高治疗功效。尽管可以获得大量不同的化学治疗剂，但这些疗法具有许多缺点。例如，由于对不论是正常还是恶性的快速生长的细胞的非特异性副作用，化学治疗剂众所周知是有毒的；例如，化学治疗剂引起显著且通常是危险的副作用，包括骨髓抑制、免疫抑制和胃肠道不适等。癌症干细胞癌症干细胞包含肿瘤的独特子群体(通常为0.1-10％左右)，其相对于其余90％左右的肿瘤(及肿瘤块)来说具有更高的肿瘤原性，生长相对更慢或沉寂，并且与肿瘤块相比通常相对更具化疗耐药性。考虑到常规疗法和方案大部分被设计成攻击快速增殖的细胞(即构成肿瘤块的那些癌细胞)，因此与快速生长的肿瘤块相比通常生长缓慢的癌症干细胞可能对常规疗法和方案相对更有抗性。癌症干细胞可以表现出使它们相对更具化疗耐药性的其他特点，例如多药耐药性和抗凋亡途径。上述因素构成了标准肿瘤治疗方案未能在具有晚期癌症的大多数患者中确保长期益处，即未能足够地靶向并根除癌症干细胞的关键原因。在某些情况下，癌症干细胞是肿瘤的生成细胞(即它是构成肿瘤块的癌细胞的祖先)。IL-2已被用于治疗几种癌症，例如肾细胞癌和转移性黑素瘤。可商购的IL-2是一种重组蛋白，其是非糖基化的，具有移除的丙氨酸-1并用丝氨酸-125代替残基半胱氨酸-125(Whittington等，1993)。尽管IL-2是癌症治疗中最早的FDA批准的细胞因子，但已显示IL-2在以高剂量使用时表现出严重副作用。这极大限制了它在潜在患者上的应用。所述严重副作用的潜在机制已被归因于IL-2与其受体之一IL-2Rα的结合。通常，IL-2不仅可以与其包括IL-2Rα(或CD25)、IL-2Rβ(或CD122)和IL-2Rγ(或CD132)(当所有三种受体存在于组织中时)在内的受体形成异三聚体复合物，而且可以与IL-2Rβ和IL-2Rγ形成异二聚体复合物。在临床背景中，当使用高剂量IL-2时，IL-2开始结合IL-2αβγ，其是Treg细胞中的主要受体形式。Treg细胞的抑制效应引起在癌症免疫疗法中应用IL-2的不想要的效应。为了减轻IL-2的副作用，以前已使用了许多方法。Nektar制造了一种形式的IL-2，其使用6个PEG化的赖氨酸来掩蔽IL-2表面上的IL2Rα结合区(Charych等，2016)。这种PEG化的IL-2形式具有延长的半衰期，包含单和多PEG化的形式的混合物，含有非常大量的PEG，而且显示出改善的副作用。然而，来自于活性研究的结果显示，在这种非均质6-PEG化的IL-2混合物中有效的PEG化的IL-2形式是仅仅单PEG化的形式。因此，需要调节IL-2的副作用的具有均质的明确的产物组成的更有效的PEG化的IL-2。将非遗传编码的氨基酸并入到蛋白质中的能力允许引入可以为天然存在的官能团例如赖氨酸的ε–NH2、半胱氨酸的巯基–SH、组氨酸的亚氨基等提供有价值的替选物的化学官能团。某些化学官能团已知对20种常见的遗传编码的氨基酸中存在的官能团是惰性的，但干净高效地反应形成稳定的键。例如，在本领域中已知叠氮基和乙炔基在水性条件下，在催化量的铜存在下经历Huisgen[3+2]环加成反应。参见例如Tornoe等，(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064；和Rostovtsev等，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。通过例如在蛋白质结构中引入叠氮基组成部分，人们能够并入对蛋白质中存在的胺、巯基、羧酸、羟基化学惰性，但与乙炔组成部分顺利且高效地反应以形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔组成部分的情况下，所述叠氮基在其他蛋白质侧链存在下和生理条件下保持化学惰性和无反应性。除了其他问题之外，本专利技术致力于解决与IL-2多肽偶联物的活性和生产相关的问题，并且也致力于生产具有改进的生物或药理性能例如对肿瘤的提高的活性和/或改进的偶联和/或改进的治疗半衰期的IL-2多肽。本专利技术的IL-2多肽靶向已知表达三聚体IL-2受体(α、β和γ)的Treg细胞和主要表达IL-2受体的β和γ二聚体的CD8细胞两者。本专利技术的IL-2多肽减少与Treg细胞的α受体的结合并促进与C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含一个或多个非天然编码的氨基酸的IL-2多肽，其中所述IL-2多肽与野生型IL-2相比与其受体亚基的相互作用降低。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180911 US 62/729,925;20190308 US 62/815,9641.一种包含一个或多个非天然编码的氨基酸的IL-2多肽，其中所述IL-2多肽与野生型IL-2相比与其受体亚基的相互作用降低。


2.权利要求1的IL-2，其中所述IL-2多肽与SEQIDNO：2或SEQIDNO：390％同源。


3.权利要求1的IL-2，其中所述IL-2多肽与SEQIDNO：2至少95％同源。


4.权利要求1的IL-2，其中所述IL-2多肽与SEQIDNO：2至少98％同源。


5.权利要求1的IL-2，其中所述IL-2多肽与SEQIDNO：2至少99％同源。


6.权利要求1的IL-2，其中所述IL-2被偶联到一个或多个水溶性聚合物。


7.权利要求6的IL-2，其中至少一个所述水溶性聚合物被连接到至少一个所述非天然编码的氨基酸。


8.权利要求7的IL-2，其中所述水溶性聚合物是PEG。


9.权利要求8的IL-2，其中所述PEG具有10至50之间的分子量。


10.权利要求1的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸被替换在选自下述残基的位置处：第1位之前(即N-端处)、第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133位，或被添加到所述蛋白质的羧基端，及其任何组合。


11.权利要求10的IL-2，其中所述IL-2与野生型IL-2相比包含调节所述IL-2多肽对其IL2Rα受体亚基的亲和性的一个或多个氨基酸替换、添加或缺失。


12.权利要求10的IL-2，其中所述IL-2包含提高所述IL-2的稳定性或溶解性的一个或多个氨基酸替换、添加或缺失。


13.权利要求10的IL-2，其中所述IL-2包含提高所述IL-2多肽在重组宿主细胞中的表达或体外合成的一个或多个氨基酸替换、添加或缺失。


14.权利要求10的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸被替换在选自第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位残基及其任何组合的位置处。


15.权利要求10的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸对原本对所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一者无反应性的接头、聚合物或生物活性分子具有反应性。


16.权利要求10的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。


17.权利要求16的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸包含羰基。


18.权利要求10的IL-2，其中所述IL-2被连接到生物活性分子、细胞毒性药剂、水溶性聚合物或免疫刺激剂。


19.权利要求18的IL-2，其中偶联的IL-2被附连到一个或多个水溶性聚合物。


20.权利要求18的IL-2，其中所述生物活性分子、细胞毒性药剂或免疫刺激剂通过接头连接到所述IL-2。


21.权利要求18的IL-2，其中所述生物活性分子、细胞毒性药剂或免疫刺激剂通过可切割或不可切割的接头连接到所述IL-2。


22.权利要求18的IL-2，其中所述生物活性分子、细胞毒性药剂或免疫刺激剂被直接偶联到所述IL-2中的一个或多个所述非天然编码的氨基酸。


23.权利要求10的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸具有下述结构：



其中n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；R2是H、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基；R3是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R4是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。


24.权利要求23的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸包含氨氧基。


25.权利要求23的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸包含酰肼基。


26.权利要求23的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸包含肼基。


27.权利要求23的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸残基包含氨基脲基。


28.权利要求23的IL-2多肽，其中所述非天然编码的氨基酸残基包含叠氮基。


29.权利要求1的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸具有下述结构：



其中n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。


30.权利要求29的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸包含炔基。


31.权利要求1的IL-2，其中所述非天然编码的氨基酸具有下述结构：



其中n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。


32.权利要求7的IL-2，其中所述水溶性聚合物具有约0.1kDa至约100kDa之间的分子量。


33.权利要求32的IL-2多肽，其中所述水溶性聚合物具有约0.1kDa至约50kDa之间的分子量。


34.权利要求16的IL-2，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基通过酰胺键连接到所述水溶性聚合物。


35.权利要求19的IL-2，其通过将包含羰基的水溶性聚合物与包含含有氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的非天然编码的氨基酸的多肽进行反应来制造。


36.权利要求1的IL-2，其中所述IL-2被糖基化。


37.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈思耕，卢迎春，哈努尔·拉希德，尼克拉斯·克努森，田丰，
申请(专利权)人：润俊中国有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港;81