一种用于判别群多普利个体化用药型的检测产品制造技术

本发明专利技术提供一种用于判别降高血压药物群多普利的个体化用药型的检测产品。其制备方法包括：根据待测的多个目的SNP位点分别设计多重扩增引物和延伸引物；配制多重扩增引物反应体系和延伸引物反应体系；在反应体系中，用多套引物同时分别对多个目的SNP位点进行扩增和单碱基延伸反应；将单碱基延伸反应后的产物进行飞行时间质谱分析，鉴定不同药物代谢相关SNP的基因型，指导降高血压药物群多普利的个体化用药。本发明专利技术能同时检测5个群多普利药物代谢相关的SNP位点，并具有成本低、无需合成探针、耗时短、结果分析简单便捷、应用领域极其广泛的优点。可以用于临床需要服用群多普利的高血压患者的辅助诊断、治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种用于判别群多普利个体化用药型的检测产品
本专利技术属于分子生物学检测领域，涉及一种利用质谱特征峰图检测多重PCR单碱基延伸产物的方法及其产品，该方法可以在3个多重PCR反应中同时检测多个PCR单碱基延伸扩增的寡核苷酸产物。更具体的说，该方法利用不同目的寡核苷酸片段在质谱分型过程中生成的不同的时间飞行质谱特征峰图，针对多个目的SNP位点同时进行检测，指导降高血压药物群多普利的用药。
技术介绍
人类的遗传信息储存在基因组中，2002年国际合作项目人类基因组计划的最终完成，绘制出了人类基因组结构的精细图，为相关研究提供了参考序列。人类基因组序列共由30亿个碱基组成，大量研究表明，人群中>1％的遗传差异大约占基因组序列的0.1％左右，即大约300万个碱基的差异，在人群中超过1％的变异频率。这些差异极有可能是造成两个人之间个体差异的遗传因素。发现这些位点，可广泛地应用于遗传标记的研究、评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。在人类基因组中，约90％的差异是以单个核苷酸的形式体现出来的，这样的差异位点被称作单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)。SNP具有两个显著的特点：一是数目众多，据估计人类基因组中的SNP数目约在1100万左右，目前NCBIdbSNP数据库中已收录来源于人类基因组的SNP达1083万，其中经过确认的为644万(截至2007年8月22日)，如此大量的SNP方便了选择合适的位点进行疾病研究，也使得绝大多数基因组区域在SNP覆盖范围内；另外一个特点是SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表现形式(基因型)，这样很容易就能设计出高通量自动化的检测方法。正因为这两个特点，使得SNP位点越来越受到研究者的青睐，被誉为是继限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)和短串联重复序列(shorttandemrepeat，STR)之后的第三代分子标记物。人类基因组计划完成前后，基因组学研究的重点逐渐转向SNP领域，因此，SNP在遗传标记学、生物群体遗传学、生物分类学、遗传育种学、物种或人类进化学、法科学、药物基因组学等领域都有重要的应用。心血管疾病是全球人类健康的首要疾病负担。我国心血管病患病率处于持续上升阶段。高血压是最常见的心血管疾病之一，也是心血管病的主要危险因素。高血压病人全球约有6.9亿人，发病率高达31.3％。流行病学研究显示，血压水平与心血管病发病率呈线性相关；血压升高是脑卒中和冠心病发病的独立危险因素。高血压是引起危及生命的心、脑血管病如心肌梗死、脑卒中、肾脏功能不全等的主要原因。因此，有效控制血压对防止高血压患者心脑血管并发症的发生具有重大的临床意义。临床上用于治疗高血压的药物主要分为五类：利尿剂、β-肾上腺素受体阻滞剂、钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂。后两者都是作用于RAAS系统的抗高血压药物。为了降低相关的病死率及致残率，高血压患者通常需要长期服用降压药物。群多普利为血管紧张素转换酶抑制剂，在体内转化成群多普利酸后发挥作用。对ACE有高度亲和力，为强效、长效ACE机制剂。临床主要用于治疗动脉高血压，对其他类型高血压也有一定疗效，且口服起效快、作用时间长、不良反应少。此外还可以治疗充血性心衰和心肌梗死。药物基因组学已成为指导临床用药、评估严重药物不良反应发生风险的重要工具。通过检测药物代谢酶和药物靶点基因，可指导临床医生针对特定患者选择合适的降压药物和给药剂量，提高降压药物治疗的有效性和安全性。药物发挥作用的各个环节都可能因基因变异而表现出明显的差异性反应。药物作用的差异表现为药物动力学和药效学的差异。由美国国立卫生研究院(NIH)创建的药物基因组学知识库(PharmGKB，ThePharmacogenetics&Pharmacogenomicsknowledgebase)，收集了史上最完整的与药物基因组相关的基因型和表型信息，并将这些信息系统地归类，是目前全球最重要的药物基因组学知识库，依据其制定的临床药物基因组实施协作组(CPIC，ClinicalPharmacogeneticsImplementationConsortium)是药物基因组学临床部署遵循的主要规范。研究表明，群多普利存在多个代谢相关的基因位点。例如，国家卫生计生委合理用药专家委员会和中国医师协会高血压专业委员会共同编写的《高血压合理用药指南(第2版)》筛选出了PharmGKB和CPIC中群多普利的吸收、转运、代谢、效应相关的5个基因座位(PTGER3、AGT、MME、BDKRB2、PTPRD)的5个多态性位点信息。进行降压药物选择指导的基因检测。根据检测的基因型结果所指向的用药建议，进行更适于个体遗传背景的降压药物种类及剂量选择，从而提高降压药物治疗的有效性和安全性。与传统的SNP检验方法不同，近年发展起来的新型软电离生物质谱——基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，即Matrix-AssistedLaserDesorptionIonisationTime-Of-FlightMassSpectrometry(MALDI-TOFMS)[1，2]同时具备灵敏度高，通量高，特异性好，成本低廉，操作简单，环境友好等优点。MALDI-TOFMS仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。MALDI-TOF这种软电离技术，不产生或产生较少的碎片离子。由于分子量是有机化合物最基本的理化性质参数，分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。MALDI-TOFMS基因分型技术基于“引物延伸法”，即延伸引物在待检测SNP位点上延伸一个或若干个碱基，然后根据延伸产物所带荧光的不同或其分子质量的不同而确定其基因型(图1)。目前市场上基于MALDI-TOFMS开发的一些具体的SNP检测方法有：美国Sequenom公司的hME和iPLEX方法，德国Bruker公司的GOODassay方法，韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。这些方法的原理是设计一条与待检测SNP位点上游的基因组序列匹配的寡核苷酸探针，根据SNP位点的基因型差异，探针将在待检测SNP位点处连接上不同的脱氧核苷酸。其中，组成DNA片段的四种脱氧核苷酸的分子量分别是：dAMP313.21Da，dCMP289.19Da，dGMP329.21Da，dTMP304.20Da。不同脱氧核苷酸之间是存在分子量差异的，其中差异最小的是dAMP与dTMP之间的9.01Da，差异最本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过特定引物组合物所制备的用于判别降高血压药物群多普利个体化用药的检测产品，其特征在于，该引物组合包括针对能判别用药型的5个SNP标记的PCR引物对和延伸引物，其中，PCR引物序列对选自如SEQ ID NO:1a-5a所示的序列，延伸引物序列选自如SEQ ID NO:1b-5b所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种通过特定引物组合物所制备的用于判别降高血压药物群多普利个体化用药的检测产品，其特征在于，该引物组合包括针对能判别用药型的5个SNP标记的PCR引物对和延伸引物，其中，PCR引物序列对选自如SEQIDNO:1a-5a所示的序列，延伸引物序列选自如SEQIDNO:1b-5b所示的序列。


2.权利要求1所述的检测产品，其中该引物组合物为独立进行的多重PCR反应引物组合物，并且所述序列如下所示：





3.权利要求2所述的检测产品，其中各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如下所示：





4.权利要求3所述的检测产品，其中上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括5-15个保护碱基序列，优选为10bp的t...

【专利技术属性】
技术研发人员：马庆伟，钟逾，刘昕超，
申请(专利权)人：北京毅新博创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11