从铁锈污染微量生物检材中提取DNA的试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供一种从铁锈污染微量生物检材中提取DNA的试剂盒及方法，包括一种能够高效从铁锈污染微量生物检材中除去铁锈的组合物溶液，该组合物溶液由羟基乙叉二膦酸(HEDP)、十二烷基硫酸钠(SDS)，肌氨酸，十二烷基肌氨酸钠，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，胆酸，脱氧胆酸，苯甲酰氨基丙酸(BATC)，辛基苯酚聚乙氧基化物，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇，1，4‑哌嗪二‑(乙磺酸)，N‑(2‑乙酰氨基)‑2‑氨基乙磺酸，聚乙二醇‑叔辛基苯基醚(Triton.RTM。X‑100)，(1，1，3，3‑四甲基丁基)苯基‑聚乙二醇(Triton.RTM.X‑114)以及水组成，该组合物溶液能够作为释放DNA裂解液应用在微量生物检材中提取DNA试剂盒中。

【技术实现步骤摘要】
从铁锈污染微量生物检材中提取DNA的试剂盒及方法
本专利技术涉及生物检材除杂领域，具体涉及一种能够从铁锈污染微量生物检材中提取DNA的试剂盒及方法。
技术介绍
STR-PCR检验技术是法医DNA检验中使用的常规方法，并在实践中发挥了显著作用。但目前对于混合检材、降解检材、微量检材以及被土壤、色素、铁锈等污染的检材，使用常规检验技术难以得到理想的实验结果。虽然已经建立了多种DNA提取纯化技术，以及一些商品化磁珠法DNA提取试剂盒，比如Qiagen的M48，Thermo的Automate、Promega的IQ提取系统等，可以进行高质量的DNA提取，但由于现场检材的来源多样性和样品的复杂性，使用不同方法获得的检验效果也存在很大差异，因此针对不同检材的差异性，选择合适的提取方法是很具有重要意义的。本专利技术涉及的一种铁锈污染的DNA提取是试剂盒及方法是因为现有的商品化试剂盒如Qiagen的M48，Thermo的Automate、Promega的IQ提取系统等很难从铁锈污染微量生物检材中提取DNA，导致微量生物检材检验失败。铁锈是一些铁的氧化物的统称，通常为红色，由铁和氧气在潮湿环境下生成。不同情况下会生成不同形式的铁锈。铁锈主要由三氧化二铁水合物Fe2O3·nH2O和氢氧化铁(FeO(OH)，Fe(OH)3)组成。法医物证中铁锈检材的主要来源是盗窃案件中的攀爬痕迹，作案工具等，这一类群检材在法医DNA检验中占很大比例，人体细胞在这些检材上长时间存留后，由于环境中的微生物、核酸酶对DNA的降解以及铁锈对DNA的破坏等原因，使得铁锈斑迹上人DNA的含量严重降解，而现有的成熟商品化磁珠法DNA提取试剂盒很难从这类检材中提出DNA，导致检测失败。因为铁锈主要成分为Fe2O3，FeO(OH)，Fe(OH)3，与磁珠结构相似，首先会干扰DNA结合磁珠，其次会抑制PCR，因此对此类生物检材，如何能高效的除去铁锈是保证其DNA检测的准确性和高效果的前提，现有技术(参见中国专利CN109402113A、CN107267502A、CN108866049A以及CN105647910A等)中针对DNA检测中铁锈的干扰主要是对磁珠进行表面进行修饰改性，异排除铁锈对DNA结合的干扰，但是无法彻底降低铁锈的影响。基于现有技术存在的问题，本专利技术从源头出发，提供一种能够高效从铁锈污染微量生物检材中除去铁锈的组合物溶液，并以此组合溶液作为裂解液制备相应的DNA提取试剂盒，在源头上除去铁锈，大大提高检测的准确性。
技术实现思路
本专利技术提供一种能够高效从铁锈污染微量生物检材中除去铁锈的组合物溶液，并以此组合溶液作为裂解液制备相应的DNA提取试剂盒，大大提高检测的准确性。本专利技术提供了一种能够高效从铁锈污染微量生物检材中除去铁锈的组合物溶液，由以下组分组成：羟基乙叉二膦酸(HEDP)、十二烷基硫酸钠(SDS)，肌氨酸，十二烷基肌氨酸钠，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，胆酸，脱氧胆酸，苯甲酰氨基丙酸(BATC)，辛基苯酚聚乙氧基化物，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇，1，4-哌嗪二-(乙磺酸)，N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸，聚乙二醇-叔辛基苯基醚(Triton.RTMX-100)，(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇(Triton.RTM.X-114)以及水；除水以外的组分的浓度均在1％-10wt％。所述组合物溶液还包括TNE。本专利技术还提供了一种从铁锈污染微量生物检材中提取DNA试剂盒，包括：上述组合物溶液作为的释放DNA裂解液、结合液、清洗液、洗脱液以及磁珠。结合液：异硫酸胍、盐酸胍的浓度分别为2M，吐温-20、吐温-80的质量浓度在0.1％-5％。清洗液：清洗液I由浓度为10mMTris，浓度为0.2％NaCl，80％的酒精。清洗液II由80％酒精组成。磁珠：100纳米的羟基磁珠。洗脱液：10mM的Tris-base缓冲液，PH为7.5。本专利技术还提供了提取铁锈污染微量生物检材DNA具体步骤如下：1.将检材放入裂解套管中，加入390μl含铁锈裂解液、10μl20mg/mlPK酶，充分混匀；2.56℃裂解45min，金属浴转速1000rpm；3.将裂解后的裂解套管于13000rpm离心3min，转移上清液至新的EP管中；4.向EP管中加入400μl结合液、10μl磁珠，漩涡震荡混匀，吸附10min；5.吸附后将EP管放在磁力架上，待完全澄清后，用移液枪吸出管内溶液；6.加入600μl清洗液I，漩涡震荡，置于磁力架静置，用移液枪吸出溶液；7.向EP管中加入300μl清洗液II，漩涡震荡，置于磁力架静置，用移液枪吸出液体；8.打开管盖，将磁珠空气干燥5min，等待酒精自然挥发；9.用移液枪吸取20μl超纯水加入EP管中，65℃震荡加热10min，转速1500rpm；10.将EP管放于磁力架静置，吸出溶液转移到新的0.2mlPCR管中，即得到纯化好的DNA溶液。本专利技术的有益效果：1.由于羟基乙叉二膦酸、胆酸、脱氧胆酸和苯甲酰氨基丙酸具有弱酸性的性质(可以迅速与铁锈充分反应)，而且存在能够与Fe3+形成十分稳定的络合物的基团，四者之间协同络合，使其能够与生物材质中铁锈迅速充分发生反应形成十分稳定的络合物沉淀，使体系中不存在铁锈，也不存在游离的Fe3+，排除铁离子对PCR的抑制，同时本申请所述组合物溶液能够有效释放DNA。2.最后利用不同组分的清洗液进一步有效去除残留的及少量的铁离子，盐离子等，保证DNA纯度。本专利技术还提供了一种从铁锈污染微量生物检材中提取DNA试剂盒，包括释放DNA裂解液、结合液、平衡液、清洗液、洗脱液以及磁珠；所述释放DNA裂解液由HEDP，TNE，十二烷基硫酸钠，肌氨酸，十二烷基肌氨酸钠，十六烷基三甲基溴化铵，胆酸，脱氧胆酸，苯甲酰氨基丙酸，辛基苯酚聚乙氧基化物，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇，1，4-哌嗪二-(乙磺酸)，N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸，聚乙二醇-叔辛基苯基醚，(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇，水组成；所述平衡液包括甲酰基柠檬酸三乙酯，氧化聚乙烯蜡，无水乙醇，比例为1-2∶3-6∶50；所述释放DNA裂解液、结合液、平衡液的添加量比例为2-4∶4-8∶1。进一步地，所述结合液包括异硫酸胍、盐酸胍、吐温-20、吐温-80的混合物。进一步地，所述清洗液包括清洗液I和清洗液II；所述清洗液I的组分为Tris、NaCl、酒精，所述清洗液II的组分为酒精。进一步地，所述磁珠为100纳米羟基磁珠。进一步地，所述洗脱液为Tris缓冲液。进一步地，所述释放DNA裂解液的组分的质量体积浓度在1％-10％。进一步地，所述异硫酸胍、盐酸胍的浓度分别为2M，所述吐温-20、吐温-80的质量浓度在0.1％-5％。进一步地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够高效从铁锈污染微量生物检材中除去铁锈的组合物溶液，由以下组分组成：羟基乙叉二膦酸、十二烷基硫酸钠，肌氨酸，十二烷基肌氨酸钠，十六烷基三甲基溴化铵，胆酸，脱氧胆酸，苯甲酰氨基丙酸，辛基苯酚聚乙氧基化物，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇，1，4-哌嗪二-(乙磺酸)，N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸，聚乙二醇-叔辛基苯基醚，(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇以及水。/n

【技术特征摘要】
1.一种能够高效从铁锈污染微量生物检材中除去铁锈的组合物溶液，由以下组分组成：羟基乙叉二膦酸、十二烷基硫酸钠，肌氨酸，十二烷基肌氨酸钠，十六烷基三甲基溴化铵，胆酸，脱氧胆酸，苯甲酰氨基丙酸，辛基苯酚聚乙氧基化物，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇，1，4-哌嗪二-(乙磺酸)，N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸，聚乙二醇-叔辛基苯基醚，(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇以及水。


2.根据权利要求书1所述一种能够高效从铁锈污染微量生物检材中除去铁锈的组合物溶液，除水以外的组分的浓度均在1％-10wt％。


3.根据权利要求书1所述一种能够高效从铁锈污染微量生物检材中除去铁锈的组合物溶液，所述组合物溶液还包括TNE。


4.一种从铁锈污染微量生物检材中提取DNA的试剂盒，包括：采用权利要求1-3任一项所述组合物溶液作为的释放DNA裂解液、结合液、清洗液、洗脱液以及磁珠。


5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：严安心，凃政，陈静，李永久，罗冰科，朱传红，钟巧梅，黄利维，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，武汉瑞博科创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11