一种常温机械器官灌注液及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种常温机械器官灌注液及其制备方法，基于每1000mL的总体积，其由以下物质和余量水组成：基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶II，其包括：聚合血红蛋白4～5g；硫氧还蛋白过氧化物酶II 1g；肝素钠3000～5000u；葡萄糖1～2g；氯化钠0.8～1.5g；头孢西丁钠0.25～0.3g；碳酸氢钠0.15～0.25g；10％复方氨基酸注射液6～10mL；和注射用12种复合维生素0.025～0.03mL。该器官灌注液中，聚合血红蛋白通过与硫氧还蛋白过氧化物酶的协同配合，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性，从而显著延长了离体器官的保存时间。

A normal temperature mechanical organ perfusion solution and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种常温机械器官灌注液及其制备方法
本专利技术涉及医疗器械领域，具体涉及一种常温机械器官灌注液及其制备方法。
技术介绍
人类很多的疾病来自细胞、组织、器官坏死，从而导致功能丧失，引发人体残疾，甚至死亡，随着现代医学的发展，器官移植技术日趋成熟，单从手术角度来说，器官移植技术已很完美，换头手术都不是大问题。而事实上，器官移植目前仍面临种种困难，对离体器官的保存就是其中之一。器官移植必需移植活的器官，因此，供移植用的器官，从切离供者体内之时起直到其主要血管与受者血管接通期间，始终保持着完整的解剖结构和活性，是移植成功的一个前提。但是，任何器官一旦失去血液供应，细胞得不到所必需的氧和养料，在常温下于短期内即会死亡，能耐受的时间是极短的，如心、肝仅10-15分钟，肾约在45-60分钟，若超过上述时限，移植后就很难恢复功能。在临床实际工作中，则要求常温下的缺血时间越短越好，最好不超过3-5分钟，最长不超过7-8分钟。但是，根本不可能在如此短促的时间内完成移植手术。因此，必需设法使离体器官的活性能长时间维持。为延长对离体器官的保存时间，科学家探讨了多种方法，其中，低温保存是现在较常用的一种方法，其虽然可以有效延长器官的保存时间，但低温保存对细胞的损伤也很明显，正常情况下，细胞浸浴在高钠低钾的细胞外液内，细胞膜内的Na-KATP酶(Na泵)细胞内外钠、钾比，钠、钾交换由氧化磷酸化供能。当代谢被抑制，Na泵得不到ATP供给，细胞内蛋白产生胶体渗透压致细胞水肿。细胞内蛋白质与非透过性阴离子产生渗透拉力大约110-140mOsm/kg。低温缺血、Na泵活性受到抑制时，细胞膜电位降低。继而Na和Cl因浓度梯度而进入细胞内，为维持半透膜内外侧水平衡，所以细胞内水聚积致使细胞水肿。再者，采用灌注的方式延长离体器官的保存也是较为常用的方法，目前常用的灌注液有Krebs-Henseleit液、StThomasⅡ液，UW液和Celsior液等，但这些灌注液都缺少携氧剂，使灌注的器官始终处理缺氧状态。体外灌注液若不能向离体器官有效供氧，组织和细胞就会因缺氧而增加无氧酵解，造成酸中毒和溶酶体酶激活不良后果。保证氧的供应、维持最低能量代谢和排除代谢废物是器官体外保存中亟待解决的问题。同时，在缺氧的条件下保存的器官，在其移植再灌注中会造成显著的二次损伤,恢复血流加重保存器官损害的机理尚不完全明了，一般认为与氧自由基损害作用有关，正常情况下，ATP的代谢产物次黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶(XOD)迅速地转变为嘌呤进而转变为中产物尿酸。然而，在缺氧严重的情况下，高能键很快耗尽，次黄嘌呤含量增加，XOD转变为一种能产生过氧化物的酶。同时，缺氧也使内源性抗氧化剂如过氧化物歧化酶(SOD)失活或耗尽，当血循环重建氧供，就会产生过量的自由基损伤细胞。所以，在器官灌注液中加入携氧剂显得尤为重要。红细胞是动物体内天然的氧载体，曾有人将其直接用于器官体外灌注保存。然而，红细胞容易发生破裂，膜内氨基磷脂、内毒素、血型糖蛋白和胞内酶的外渗都可能损伤血管内皮及心肌细胞并造成毛细血管阻塞。因此，采用无基质血红蛋白代替红细胞是一条新思路。血红蛋白是红细胞中具有载氧功能的蛋白，呈球形结构，分子量为64.5kKD。经过Pemtz等人的多年研究，目前对血红蛋白的结构和功能已经有了较为透彻的了解。血红蛋白由四条多肽链(亚基)组成，它们以非共价键相互作用结合在一起。人全血中主要成分为血红蛋白A，结构为α2β2，其中α链含有141个氨基酸残基，而β链含146个氨基酸残基，α链和β链以较紧密的方式结合成二聚体，2个αβ二聚体以较为松散的结合方式形成了血红蛋白分子。血红蛋白在体内的主要功能是运送氧气，部分二氧化碳和氢离子。四个亚基中每一条链都含有一个可以以可逆方式结合氧的血红素辅基。一个Hb四聚体共可以结合四个氧分子。四个血红素的位置处于贴近分子表面的裂隙内，除了两个组氨酸残基外，围绕血红素的几乎都是非极性残基。血红素中的铁原子在血红素的平面中心和原卟啉环的四个氧原子结合，在血红素平面的两侧，铁原子还能形成两个结合键，这成为第五和第六配位。血红素中铁原子的第五配位键和位于血红素平面一侧F8组氨酸残基(在α链中是87位His，在β链是92位His)结合，这F8His就是近心His。另一组氨基酸残基E7His(在α链中是58位His，在β链是67位His)处于血红素平面的另一侧铁原子的第六配位附近，即远心His，E7His并没有和铁原子结合，E7His和铁原子之间的空隙就是氧气结合的位置，在脱氧血红蛋白相应位置空着，O2能扩散进入到此空间，结合到铁原子的第六配位，而E7His则与氧气可通过氢键相连。血红蛋白中的血红素铁，可以有Fe2+和Fe3+，只有Fe2+才能结合氧，以Fe3+存在的血红蛋白称为高铁血红蛋白，没有结合O2的功能。血红蛋白分子中各个结合O2的位点之间有协同作用，一个亚基上结合O2后能促进这个四聚体的其余亚基与O2的结合，反之，氧合血红蛋白的一个亚基释放的O2能促进其余亚基释放出O2，这种协同效应称为希尔效应。在成熟的红细胞中，氧合血红蛋白的相互作用可以用氧解离曲线来描述，在标准条件下，总血红蛋白饱和度为50％时的氧分压为P50。在正常生理条件下，全血P50大约为26Torr。当血红蛋白的氧亲和力上升使氧分子难以从血红蛋白上解离时，氧合曲线左移且P50下降，即50％血红蛋白被氧饱和所需要的氧气减少，但氧气更难从血红蛋白上解离。2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)能够显著影响血红蛋白的氧亲和力，它在人体和其他许多动物的红细胞中存在，浓度大约与血红蛋白相同。在没有2，3-DPG存在时，血红蛋白对氧的亲和力很高，P50很低。2，3-DPG是一个高极性分子，分子量并不大，却带有5个负电荷，是代谢中间物中一个少有的荷电密度高的分子，它与血红蛋白以1：1的比例结合，结合于血红蛋白分子轴对称的中心空穴，正好填满原有的空隙。2，3-DPG是通过与脱氧血红蛋白的结合来影响血红蛋白的氧亲和力的。血红蛋白氧合过程中，2，3-DPG通过影响血红蛋白的构象，使血红蛋白趋向于紧张态(T态)，降低对O2的亲和力。从红细胞中分离纯化出的游离血红蛋白由于失去了2，3-DPG，所以氧亲和力较高，在组织中难于将结合的氧分子释放。同时，游离的血红蛋白由于失去了红细胞膜和细胞内还原酶系统(如超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白过氧化物酶等)的保护，会迅速解离成为二聚体，且被氧化成高铁血红蛋白，然后经肾脏排出体外，引起血红蛋白尿，严重的还会造成肾功能衰竭。另外，游离的血红蛋白还会施加额外的胶体渗透压，在正常的生理渗透压下，血红蛋白的浓度仅为7g/dL，携氧能力大大降低。因此，脱离了红细胞后的游离血红蛋白，由于具有对氧亲和力过强、稳定性差以及携氧能力过低等缺点，不能直接作为红细胞代用品进行应用。为了增加血红蛋白的稳定性，防止游离的血红蛋白四聚体的快速解离，以消除肾毒性，同时降低氧亲和力，20世纪60年代前后在国外兴起了人工聚合血红蛋白的研究和开发。血红蛋白经过分子内交联、分子间聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种离体器官灌注液，基于每1000mL的总体积，其由以下物质组成：/n基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶II，其包括：/n聚合血红蛋白4～5g；/n硫氧还蛋白过氧化物酶II 1g；/n肝素钠3000～5000u；/n葡萄糖1～2g；/n氯化钠0.8～1.5g；/n头孢西丁钠0.25～0.3g；/n碳酸氢钠0.15～0.25g；/n10％复方氨基酸注射液6～10mL；/n注射用12种复合维生素0.025～0.03mL；/n和余量水；/n其中，所述聚合血红蛋白通过如下方法获得：/n采集新鲜血液，用0.5～1倍所述血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；/n用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；/n将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；/n向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；/n用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；/n将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；/n将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；/n然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；/n接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白。/n...

【技术特征摘要】
1.一种离体器官灌注液，基于每1000mL的总体积，其由以下物质组成：
基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶II，其包括：
聚合血红蛋白4～5g；
硫氧还蛋白过氧化物酶II1g；
肝素钠3000～5000u；
葡萄糖1～2g；
氯化钠0.8～1.5g；
头孢西丁钠0.25～0.3g；
碳酸氢钠0.15～0.25g；
10％复方氨基酸注射液6～10mL；
注射用12种复合维生素0.025～0.03mL；
和余量水；
其中，所述聚合血红蛋白通过如下方法获得：
采集新鲜血液，用0.5～1倍所述血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mMtris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mMtris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液...

【专利技术属性】
技术研发人员：游可为，史国营，孙新宇，陈浩源，
申请(专利权)人：润方北京生物医药研究院有限公司，润方北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11