鉴定RNA分子中2`-O-甲基化修饰的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种鉴定RNA分子是否在核苷酸上具有2’‑O‑甲基化修饰的方法，其包括(1)让所述RNA分子与核糖核酸酶Rnase R接触；以及(2)检测所述RNA分子是否被降解或降解后终止水解的位置。其中，如果所述RNA分子被降解，则表明所述RNA分子在3’末端核苷酸上不具有2’‑O‑甲基化修饰；而多个随机打断后的片段均终止水解于同一位点，则表明所述RNA分子在终止位点上一位的核苷酸上具有2’‑O‑甲基化修饰。本发明专利技术还提供了采用该方法来筛选疾病诊断靶点以及确认受试者是否具有与2’‑O‑甲基化修饰相关的疾病的应用。本发明专利技术提供的这些方法灵敏度高，反应条件温和，操作简单。

Identification of 2 '- O-methylated modification in RNA and its application

【技术实现步骤摘要】
鉴定RNA分子中2’-O-甲基化修饰的方法及其应用
本专利技术涉及鉴定RNA分子是否具有2’-O-甲基化修饰以及确定2’-O-甲基化修饰位点的方法，还涉及这些方法在确定疾病诊断靶点以及确定受试者是否具有2’-O-甲基化修饰相关疾病方面的应用。
技术介绍
自从50多年前第一个假尿嘧啶核苷被发现，到目前为止，在生物界己经鉴定出100多种不同的RNA修饰，这些修饰主要发生在新生成的前体RNA的四种核苷碱基上，并且广泛存在于各种RNA分子中，包括转移RNA、核糖体RNA、信使RNA以及各种小RNA等。大量研究表明，植物小RNA(miRNA)也存在诸如尿苷化、甲基化等多种修饰，并参与调控了miRNA生成、稳定性等多个方面。近期的研究表明昆虫和哺乳动物体内多种小分子RNA也存在3’末端甲基化，如siRNA、hc-siRNA、ta-siRNA、nat-siRNA和piRNA。这些小分子RNA的3’末端甲基化可以使其免受细胞中多种核酸外切酶、连接酶、末端转移酶、聚合酶等可作用于核酸3’末端羟基的酶攻击，从而保持小分子RNA的稳定。已有研究表明，很多植物的miRNA在形成过程中会经历由HEN1酶甲基化的调控，这是保护其免受尿苷化的一种机制。体外活性试验表明，重构的拟南芥Hen1蛋白能作用于21至24nt的miRNA/miRNA二聚体，在每条链的3’末端核苷酸的2’-OH位点添加一个甲基基团(2’-O-methylatedgroup)。另外还发现dsRNA底物3'端2个碱基的突出和3’末端核苷酸2’-OH和3’-OH是拟南芥Hen1蛋白作用底物2个非常重要的特征。底物RNA上3’末端核苷酸的2’-OH和3’-OH对于Hen1蛋白的甲基化活性十分重要，这2个位点很可能在底物识别过程中发挥重要作用。对拟南芥Hen1蛋白的晶体结构研究表明，Hen1蛋白以单体的形式与miRNA/miRNA二聚体底物结合。该底物在其三级结构上形成一个A折叠构象，每条链的末端都能被Hen1蛋白特异识别。对Henmt1进一步研究表明，在试管实验中，哺乳动物中Hen1同源蛋白Henmt1可以以21至24nt单链小RNA(ssRNA)为底物，以腺苷甲硫氨酸(AdoMet)为甲基供体甲基化修饰小RNA。有研究显示miRNA存在多种修饰，并且多种修饰丰度在肿瘤样品中升高。LC-MS/MS分析结果发现，在miRNA样品中一共发现12种甲基化修饰，其中包括3’端2’-O-甲基腺苷(Am)，2’-O-甲基尿苷(Um)，2’-O-甲基鸟苷(Gm)，2’-O-甲基胞苷(Cm)，更有意思的是3’端2’-O-甲基化修饰丰度在肿瘤样品中显著升高。这些结果提示哺乳动物miRNA存在多种多样的修饰，并且这些修饰很可能参与了肿瘤等疾病的发生和发展。而这些修饰，也许具备了成为肿瘤诊断的标志物的潜力。目前已有多种方法应用于2’-O-甲基化的检测。陈雪梅课题组利用miRNA末端2’-O-甲基化对于羟基的保护作用，高碘酸钠氧化，β消除，RNA纯化等一系列操作，检测出甲基化与非甲基化的miRNA。董志伟等通过特殊设计的逆转录引物，识别甲基化的位点，在低浓度dNTP的情况下有2’-O-甲基化修饰时，将不能进行RNA的逆转录，而非甲基化的位点则能正常逆转录。这一方法在人与酵母菌的核糖体RNA，小鼠的piRNA中均得到了验证。有报道发现，由于植物miRNA甲基化的存在，颈环法相对于加尾法，在检测植物miRNA时效率更高。同时，AndreasMarx等设计出对于甲基化位点无差异扩增的逆转录酶，与对甲基化不敏感的酶比较，通过不同检测方法的差异用于检测甲基化。王向东设计三种等温引物反应方式，使其更加灵敏的检测3’末端2’-O-甲基化的植物miRNA。JOANA.STEITZ等开发了以一种更加灵敏的方法检测甲基化的位点。他们通过设计一段RNA-DNA-RNA序列的单核苷酸识别甲基化位点，引导RNAseH降解识别的位点，如果位点有甲基化保护，则不会被RNAseH降解，从而可以灵敏的区分甲基化与非甲基化。同时，也有研究发现不同来源的RNAseH，对于切割位点的识别也不相同。然而，以上多种检测miRNA甲基化的方法，仍存在灵敏性较低，对样本要求量大的缺点。
技术实现思路
在一方面，本专利技术提供了一种鉴定RNA分子是否在3’末端核苷酸上具有2’-O-甲基化修饰的方法，包括：(1)让所述RNA分子与核糖核酸酶RnaseR接触；以及(2)检测所述RNA分子是否被降解；其中，如果所述RNA分子被降解，则表明所述RNA分子在3’末端核苷酸上不具有2’-O-甲基化修饰。在一些实施方案中，所述核糖核酸酶RnaseR具有SEQIDNO：3或4所示的氨基酸序列，或者，与SEQIDNO：3或4所示的氨基酸序列相比，所述核糖核酸酶RnaseR具有一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、添加，或者具有至少95％序列一致性，并具有外切核糖核酸酶活性。在一些实施方案中，步骤(2)包括使用凝胶电泳或RT-PCR进行所述检测。在一些实施方案中，所述RNA分子为miRNA。另一方面，本专利技术提供了一种筛选能够作为疾病的诊断靶点的miRNA的方法，其包括：(1)分别从患有所述疾病的患者和正常人获取所述miRNA；以及(2)以上述方法鉴定所述miRNA是否具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰，其中，将所述患者中具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰而正常人不具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰的miRNA作为所述疾病的诊断靶点。在一些实施方案中，所述疾病为癌症、基因紊乱性遗传疾病、或发育错误。优选地，所述疾病为肺腺癌。另一方面，本专利技术提供了一种在受试者中确定与miRNA的3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰相关的疾病的方法，包括：(1)从来自所述受试者的生物样品中获取所述miRNA；以及(2)以上述方法鉴定所述miRNA是否具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰，其中，如果所述miRNA具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰，而正常人所述miRNA不具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰，则认为所述受试者具有所述与miRNA的3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰相关的疾病。在一些实施方案中，所述miRNA提取自所述受试者的血清。在一些实施方案中，所述疾病为癌症、基因紊乱性遗传疾病、或发育错误。优选地，所述疾病为肺腺癌。另一方面，本专利技术提供了表2中列出的miRNA作为疾病诊断靶点的应用。在一些实施方案中，所述疾病为肺腺癌。另一方面，本专利技术提供了一种用于在受试者中检测与miRNA的3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰相关的疾病的试剂盒，其包括核糖核酸酶RnaseR。在一些实施方案中，所述核糖核酸酶RnaseR具有SEQIDNO：3或4所示的氨基酸序列，或者，与SEQIDNO：3或4所示的氨基酸序列相比，所述核糖核酸酶RnaseR具有一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、添加，或者具有至少95％序列一致性，并具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定RNA分子是否在3’末端核苷酸上具有2’-O-甲基化修饰的方法，包括：/n(1)让所述RNA分子与核糖核酸酶Rnase R接触；以及/n(2)检测所述RNA分子是否被降解，/n其中，如果所述RNA分子被降解，则表明所述RNA分子在3’末端核苷酸上不具有2’-O-甲基化修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定RNA分子是否在3’末端核苷酸上具有2’-O-甲基化修饰的方法，包括：
(1)让所述RNA分子与核糖核酸酶RnaseR接触；以及
(2)检测所述RNA分子是否被降解，
其中，如果所述RNA分子被降解，则表明所述RNA分子在3’末端核苷酸上不具有2’-O-甲基化修饰。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述核糖核酸酶RnaseR具有SEQIDNO：3或4所示的氨基酸序列，或者，与SEQIDNO：3或4所示的氨基酸序列相比，所述核糖核酸酶RnaseR具有一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、添加，或者具有至少95％序列一致性，并具有外切核糖核酸酶活性。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤(2)包括使用凝胶电泳或逆转录PCR进行所述检测。


4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述RNA分子为miRNA。


5.一种筛选能够作为疾病的诊断靶点的miRNA的方法，包括：
(1)分别从患有所述疾病的患者和正常人获取所述miRNA；以及
(2)以权利要求1至4中任一项的方法鉴定所述miRNA是否具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰，
其中，将所述患者中具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰而正常人不具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰的miRNA作为所述疾病的诊断靶点。


6.如权利要求5所述的方法，其中所述疾病为癌症。


7.如权利要求5所述的方法，其中步骤(1)包括从所述患者和正常人的血清中提取所述miRNA。


8.一种在受试者中确定与miRNA的3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰相关的疾病的方法，包括：
(1)从所述受试者获取miRNA；以及
(2)以权利要求1至4中任一项的方法鉴定所述miRNA是否具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰，
其中，如果所述miRNA具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰，而正常人所述miRNA不具有3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰，则认为所述受试者具有所述与miRNA的3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰相关的疾病。

【专利技术属性】
技术研发人员：陈奇涵，
申请(专利权)人：南京迈西可生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32