肉苁蓉中四种成分制备工艺及其应用制造技术

本发明专利技术具体公开了一种从肉苁蓉中提取、纯化并同时制备松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和管花苷A四种高纯度成分的方法和四种单一成分及其不同比例组合物在神经保护及其在骨保护作用中的应用。本发明专利技术所述方法包括：通过对药材提取、提取液醇沉、大孔树脂纯化结合HPLC‑DAD/MS组分自动收集系统进行精制，即首先采用热回流法对肉苁蓉药材进行提取；继而采用醇沉的方式进行初步纯化；然后采用大孔树脂吸附法，对四种成分进行进一步纯化，获得所需要的四种成分的苯乙醇苷部位(含量≥50％，符合新药5类中药部位的要求)；最后，利用HPLC‑DAD/MS组分自动收集系统实现四种成分单体的高效、高纯度制备，纯度均高于98％；同时对四种单一成分及其不同比例组合物进行了神经保护作用和骨保护作用研究。

Preparation and application of four components in Cistanche deserticola

【技术实现步骤摘要】
肉苁蓉中四种成分制备工艺及其应用
本专利技术属于天然产物领域，涉及天然产物的医药用途，具体涉及肉苁蓉中的四种成分单体及其不同比例组合物在神经保护和骨保护方面的应用。
技术介绍
肉苁蓉(CistanchedeserticolaMa)是列当科肉苁蓉属植物，寄生于柳属植物如梭梭、红柳、白剌、沙拐枣及蒿类等植物根部，主产地在新疆塔克拉玛干沙漠地区及其附近县。肉苁蓉的入药部分为干燥带鳞叶的肉质茎。现记载肉苁蓉分为四种一变种，即肉苁蓉、管花肉苁蓉、沙苁蓉、盐生肉苁蓉和白花盐苁蓉，药典中被收纳的品种为肉苁蓉和管花肉苁蓉。自古代医家典籍《神农本草经》中就已有肉苁蓉的记载，其具有补肾阳、益精血、润肠通便等功效，现代医学研究表明，肉苁蓉具有抗衰老，抗氧化、神经保护作用以及免疫调节作用。苯乙醇苷类物质是肉苁蓉的主要有效成分，也是肉苁蓉研究比较广泛的成分，其母核通常为β-葡萄糖，其中，苯乙基和羟基被羟基或甲氧基取代，肉桂酰基被甲氧基取代，通过酯键或糖苷键形成天然糖苷类化合物。苯乙醇苷广泛存在于很多植物中，例如玄参科、木犀科、蔷薇科、马钱科、车前科、马鞭草科等。管花肉苁蓉中，苯乙醇苷的含量可高达4％，其他肉苁蓉属植物中，苯乙醇苷的含量可达3％。目前为止，肉苁蓉中已确定出69种苯乙醇苷，其中松果菊苷含量最高，2015版药典中，规定松果菊苷和毛蕊花糖苷的总量不得少于1.5％。很多研究表明，肉苁蓉的多种药理作用，如神经保护作用与免疫作用均与苯乙醇苷有关，但仍缺乏对药效物质的微观分析，有效部位及有效成分尚未明确。鉴于苯乙醇苷的药理作用，将苯乙醇苷提取与纯化的方法研究广泛。苯乙醇苷的提取方法主要有高剪切均质化提取法、溶剂浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和超临界流体提取法。高剪切均质化提取法是基于超剪切原理，实现固相微粒化与液相的乳化。通过高剪切力，碰撞力、压力和其他力的组合，可以快速实现固体样品和溶剂间的可溶性平衡，具有用时短、溶剂量少、产率高等优点。溶剂浸提法可分为三种：冷浸渍、热浸渍和重浸渍，冷浸渍是指在常温下进行的浸渍提取，适合于高温不稳定的成分提取；热浸渍是指在水浴或者蒸汽加热的条件下进行的提取，适合于高温稳定的成分，同时提取效率高于冷浸渍；重浸渍是指多次浸渍从而提高提取效率的方法。超声波辅助提取法是指借助超声能量，使药材颗粒发生振动、升温、空化，加速溶剂进入药物颗粒内部，从而实现快速提取。微波辅助提取法是指，利用微波能量传递通过离子传导和偶极子旋转引起分子运动，连续的高温使细胞破裂，细胞内的有效物质流出，从而实现有效成分的提取。该方法需要严格控制提取时间，防止目标产物在微波的强烈作用下分解。超临界流体提取法是利用超临界流体的高密度、低粘度和高扩散系数，是从物料中萃取和分离物质的优良溶剂，大多数关于超临界流体的研究都使用CO2作为超临界流体，因其具有价格低廉、不易燃烧、安全环保、可回收等优点，是超临界流体提取的首选。苯乙醇苷的纯化方法主要有介孔碳吸附法、分子印迹法、溶剂萃取法、膜分离法、柱层析法、大孔树脂吸附法、高效逆流色谱法以及制备型高效液相色谱法。介孔碳吸附法是利用介孔碳的吸附于解吸附性能，介孔碳的内径2-50nm，而苯乙醇苷的分子大小约为2nm，因此，介孔碳可用于苯乙醇苷的纯化分离。分子印迹法分为共价分子印迹和非共价分子印迹，天然产物的分离纯化通常选择非共价分子印迹，因为其较共价分子印迹更易洗脱。溶剂萃取法即利用不同成分在不同溶剂中的溶解度，进而实现的纯化，一般纯化溶剂有石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇。膜分离法是利用分子量不同从而实现的分离。柱层析法主要分为硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、凝胶色谱柱层析，硅胶柱层析和聚酰胺柱层析均是根据所分离物质在填料上的吸附与解吸附性能而实现的分离，凝胶色谱柱是根据分子大小与形状实现的分离。大孔树脂吸附法是分离天然产物常用的手段，不同型号的大孔树脂可以分离纯化不同极性的物质。高效逆流色谱法是基于液-液分配色谱的分离纯化方法，具有高回收率，高效率等优点。制备型高效液相色谱法是利用制备型高效液相色谱载样量高、分离都高的优点，在短时间内制备苯乙醇苷。虽然松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和管花苷A这四种苯乙醇苷类成分在肉苁蓉中的含量较高，但是，由于肉苁蓉中还含有如多糖、环烯醚萜、木质素等其他物质，导致现有的从肉苁蓉药材中提取和纯化苯乙醇苷的工序均繁琐，成本高，且纯度低。因此，需要优化工序，从提取到纯化再到制备，保证较高的转移率，同时降低成本与污染。同时，虽然现有技术中肉苁蓉用于神经保护取得较好的疗效，但其中有效成分尚未明确，缺乏对药效物质的微观分析。分离提取中药有效成分，提高治疗效果，是中药研究国际化发展的热点和趋势，对开发成分较少、质量可控、机制明确的新药具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术旨在采用低廉、高效的方法同时制备肉苁蓉中四种高纯度(HPLC纯度，≥98％)主要成分(松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和管花苷A)。本专利技术是通过对药材提取、提取液醇沉、大孔树脂纯化结合HPLC-DAD/MS组分自动收集系统进行精制，最终实现四种成分同时制备的一种制备工艺方法，同时考察了四种成分部位的神经保护作用及骨相关疾病的预防和/或治疗作用，提示该部位可以用于治疗神经退行性疾病如轻度认知障碍(Mildcognitiveimpairment，MCI)、阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)、骨质疏松及促进骨折愈合等。本专利技术技术方案如下：本专利技术的第一个目的是提供一种从肉苁蓉中同时提取四种有效成分单体的方法，所述四种有效成分单体为松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、管花苷A，所述提取方法包括以下步骤：1)水提：将肉苁蓉药材切为小块，加水浸泡1～3h，水煎煮提取，提取次数为2次，获得肉苁蓉水提液；2)醇沉：将步骤1)获得的肉苁蓉水提液调整至密度为0.7～0.8(0.7～0.8g生药/mL)的醇沉溶液，采用浓度为95％的乙醇醇沉除去步骤1)获得的肉苁蓉水提液中的多糖，使醇沉溶液的终浓度为50～70％，获得醇沉上清液，将醇沉上清液4℃静置12h，离心取上清液，减压回收乙醇，水液冷冻干燥得到醇沉上清液固形物；3)纯化：采用大孔树脂对步骤2)所得的醇沉上清液固形物纯化，所述纯化条件为：将步骤2)所得的醇沉上清液固形物溶解于水，制成松果菊苷浓度为2.8mg/mL的均一澄清溶液，上样量5BV，上样流速1BV/h，先用水洗脱，水除杂体积10BV，洗脱流速2BV/h，得到水洗脱部位；25％乙醇洗脱体积15BV，洗脱流速4BV/h，得到25％乙醇洗脱部位；50％乙醇洗脱体积6BV，洗脱流速2BV/h，径高比1:8；收集25％乙醇洗脱部位，浓缩，挥去乙醇，获得纯化后的浸膏；4)HPLC-DAD/MS组分自动收集系统同时提取四种有效成分单体：将步骤3)得到的纯化后的浸膏溶解于水，制成可完全溶解的最大浓度，取5mL注入HPLC-DAD/MS组分自动收集系统，分别将6min、9min、10min和16min色谱峰进行自动收集，挥干溶剂，分别获得松果菊苷、异毛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从肉苁蓉中同时提取四种有效成分单体的方法，其特征在于，所述四种有效成分单体为松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、管花苷A，所述提取方法包括以下步骤：/n1)水提：将肉苁蓉药材切为小块，加水浸泡1～3h，水煎煮提取，提取次数为2次，获得肉苁蓉水提液；/n2)醇沉：将步骤1)获得的肉苁蓉水提液调整至密度为0.7～0.8的醇沉溶液，采用浓度为95％的乙醇醇沉除去步骤1)获得的肉苁蓉水提液中的多糖，使醇沉溶液的终浓度为50～70％，获得醇沉上清液，将醇沉上清液4℃静置12h，离心取上清液，减压回收乙醇，水液冷冻干燥得到醇沉上清液固形物；/n3)纯化：采用大孔树脂对步骤2)所得的醇沉上清液固形物纯化，所述纯化条件为：将步骤2)所得的醇沉上清液固形物溶解于水，制成松果菊苷浓度为2.8mg/mL的均一澄清溶液，上样量5BV，上样流速1BV/h，先用水洗脱，水除杂体积10BV，洗脱流速2BV/h，得到水洗脱部位；25％乙醇洗脱体积15BV，洗脱流速4BV/h，得到25％乙醇洗脱部位；50％乙醇洗脱体积6BV，洗脱流速2BV/h，径高比1:8；收集25％乙醇洗脱部位，浓缩，挥去乙醇，获得纯化后的浸膏；/n优选的，所述大孔树脂包括HPD-300、D-101-Ⅰ、D-101、HPD-100中一种或多种的混合；/n进一步优选的，所述大孔树脂还包括NKA-9，将NKA-9与HPD-300、D-101-Ⅰ、D-101和HPD-100中的一种或多种混合；/n更进一步优选的，选自HPD-300和NKA-9混合；/n4)HPLC-DAD/MS组分自动收集系统同时提取四种有效成分单体：将步骤3)得到的纯化后的浸膏溶解于水，制成可完全溶解的最大浓度，取5mL注入HPLC-DAD/MS组分自动收集系统，分别将6min、9min、10min和16min色谱峰进行自动收集，挥干溶剂，分别获得松果菊苷、异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷和管花苷A；/n所述HPLC-DAD/MS组分自动收集系统色谱条件如下：/n色谱柱：Shim-pack PRC-ODS 20×25cm；/n流动相：甲醇-甲酸水(体积比45:55，所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1％)/n流速：3mL/min；/n进样量：5mL；/n检测波长：330nm。/n...

【技术特征摘要】
1.一种从肉苁蓉中同时提取四种有效成分单体的方法，其特征在于，所述四种有效成分单体为松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、管花苷A，所述提取方法包括以下步骤：
1)水提：将肉苁蓉药材切为小块，加水浸泡1～3h，水煎煮提取，提取次数为2次，获得肉苁蓉水提液；
2)醇沉：将步骤1)获得的肉苁蓉水提液调整至密度为0.7～0.8的醇沉溶液，采用浓度为95％的乙醇醇沉除去步骤1)获得的肉苁蓉水提液中的多糖，使醇沉溶液的终浓度为50～70％，获得醇沉上清液，将醇沉上清液4℃静置12h，离心取上清液，减压回收乙醇，水液冷冻干燥得到醇沉上清液固形物；
3)纯化：采用大孔树脂对步骤2)所得的醇沉上清液固形物纯化，所述纯化条件为：将步骤2)所得的醇沉上清液固形物溶解于水，制成松果菊苷浓度为2.8mg/mL的均一澄清溶液，上样量5BV，上样流速1BV/h，先用水洗脱，水除杂体积10BV，洗脱流速2BV/h，得到水洗脱部位；25％乙醇洗脱体积15BV，洗脱流速4BV/h，得到25％乙醇洗脱部位；50％乙醇洗脱体积6BV，洗脱流速2BV/h，径高比1:8；收集25％乙醇洗脱部位，浓缩，挥去乙醇，获得纯化后的浸膏；
优选的，所述大孔树脂包括HPD-300、D-101-Ⅰ、D-101、HPD-100中一种或多种的混合；
进一步优选的，所述大孔树脂还包括NKA-9，将NKA-9与HPD-300、D-101-Ⅰ、D-101和HPD-100中的一种或多种混合；
更进一步优选的，选自HPD-300和NKA-9混合；
4)HPLC-DAD/MS组分自动收集系统同时提取四种有效成分单体：将步骤3)得到的纯化后的浸膏溶解于水，制成可完全溶解的最大浓度，取5mL注入HPLC-DAD/MS组分自动收集系统，分别将6min、9min、10min和16min色谱峰进行自动收集，挥干溶剂，分别获得松果菊苷、异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷和管花苷A；
所述HPLC-DAD/MS组分自动收集系统色谱条件如下：
色谱柱：Shim-packPRC-ODS20×25cm；
流动相：甲醇-甲酸水(体积比45:55，所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1％)
流速：3mL/min；
进样量：5mL；
检测波长：330nm。


2.根据权利要求1所述的从肉苁蓉中同时提取四种有效成分单体的方法，其特征在于，步骤1)中将所述肉苁蓉药材切为小于1cm3的小块，所述加水浸泡时间为1h。


3.根据权利要求1所述的从肉苁蓉中同时提取四种有效成分单体的方法，其特征在于，步骤1)中2次提取时间各为1h，料液比为1:11～12；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李飞，方佳艺，李英祺，吴闪闪，李萍，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32