【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有修饰的磷脂酶结构域的腺相关病毒(AAV)相关申请的交叉引用本申请要求2017年8月31日提交的美国临时申请系列第62/553,028号的权益，该申请以全文引用的方式并入本文。经由EFS-WEB以电子方式递交的序列表的引用本申请包括经由EFS-Web以电子方式递交的序列表(名称：“4226.006PC01_Sequence_Listing_ST25.txt”；大小：100,400字节；并且创建于：2018年8月22日)，其特此以引用的方式全文并入。
本公开通常涉及具有带有修饰的磷脂酶结构域的病毒衣壳蛋白的腺相关病毒(AAV)，以及使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中产生所述腺相关病毒(AAV)的方法。
技术介绍
腺相关病毒(AAV)是最有希望用于人类基因治疗的病毒载体之一。AAV含有大约4.7kb的ssDNA基因组，其表达两个ORF；一个编码病毒外壳蛋白VP1、VP2和VP3以及装配相关蛋白或装配激活蛋白(AAP)，且第二个编码四种病毒复制酶组分；ORF由两个反向末端重复序列(ITR)侧接。ITR由病毒rep蛋白识别，其中它们在新生病毒衣壳中的基因组复制及新合成基因组的装载中起关键作用。可使用载体制备重组AAV颗粒，其中目的基因(GOI)在两个ITR之间克隆，并且病毒cap和rep蛋白以反式提供。重组AAV颗粒保留了有效感染分裂以及未分裂的人类细胞的能力。病毒颗粒被认为进入细胞核，其中基因组作为附加体存留，并继续数月至数年长期表达重组载体中存在的任何转基因。重要的是，尽管AAV感...
【技术保护点】
1.一种核酸分子，其包含编码腺相关病毒(AAV)病毒衣壳蛋白的多核苷酸序列，其中所述病毒衣壳蛋白包含修饰的亚基1(VP1)序列，所述修饰的亚基1序列包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和位置64处的赖氨酸，其中所述氨基酸位置是相对于SEQ ID NO:1中给出的序列定义的，其中在位置1、26、40、43、44和64中的任何一处或多处的所述氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰，且其中除了在所述任何一个或多个位置1、26、40、43、44和64处的那些以外，没有另外的氨基酸相对于所述相应的野生型序列被修饰。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170831 US 62/553,0281.一种核酸分子，其包含编码腺相关病毒(AAV)病毒衣壳蛋白的多核苷酸序列，其中所述病毒衣壳蛋白包含修饰的亚基1(VP1)序列，所述修饰的亚基1序列包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和位置64处的赖氨酸，其中所述氨基酸位置是相对于SEQIDNO:1中给出的序列定义的，其中在位置1、26、40、43、44和64中的任何一处或多处的所述氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰，且其中除了在所述任何一个或多个位置1、26、40、43、44和64处的那些以外，没有另外的氨基酸相对于所述相应的野生型序列被修饰。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述病毒衣壳蛋白选自由以下组成的组：
(i)来自AAV1的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:15中给出的序列；
(ii)来自AAV3的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:16中给出的序列；
(iii)来自AAV4的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:17中给出的序列；
(iv)来自AAV5的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:18中给出的序列；
(v)来自AAV6的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:19中给出的序列；
(vi)来自AAV7的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:20中给出的序列；
(vii)来自AAV8的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:21中给出的序列；
(viii)来自AAV9的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:22中给出的序列；
(ix)来自AAV10的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:23中给出的序列；
(x)来自AAV11的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:24中给出的序列；
(xi)来自AAV12的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:25中给出的序列；和
(xii)来自AAV13的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:26中给出的序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的核酸分子，其中所述病毒衣壳蛋白来自AAV8，且所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:21中给出的序列。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的核酸分子，其中所述病毒衣壳蛋白来自AAV9，且所述修饰的VP1序列包含SEQIDNO:22中给出的序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，其中所述病毒衣壳蛋白包含来自与所述修饰的VP1相同的AAV血清型的亚基2(VP2)和亚基3(VP3)序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，其中编码所述AAV病毒衣壳蛋白的所述核苷酸序列与用于在昆虫细胞中表达的启动子可操作地连接。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其中所述用于在昆虫细胞中表达的启动子是多面体启动子或p10启动子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其包含编码至少一种选自Rep78和Rep68的大AAV复制(Rep)蛋白和至少一种选自Rep52和Rep40的小AAVRep蛋白的多核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其包含编码Rep78和Rep52的多核苷酸序列。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的核酸分子，其中编码所述Rep蛋白的所述多核苷酸序列与用于在昆虫细胞中表达所述Rep蛋白的启动子可操作地连接。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其中所述用于在昆虫细胞中表达的启动子是多面体启动子或p10启动子。
12.一种杆状病毒载体，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的核酸分子。
13.多种杆状病毒载体，其包含：
(i)第一杆状病毒载体，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的核酸分子；和
(ii)第二杆状病毒载体，其包含编码由AAV反向末端重复(ITR)序列侧接的目的蛋白质或RNA的多核苷酸。
14.多种杆状病毒载体，包含：
(i)第一杆状病毒载体，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子；
(ii)第二杆状病毒载体，其包含编码至少一种选自Rep78和Rep68的大AAV复制(Rep)蛋白和至少一种选自Rep52和Rep40的小AAVRep蛋白的多核苷酸序列；和
(iii)第三杆状病毒载体，其包含编码由AAV反向末端重复(ITR)序列侧接的目的蛋白质或RNA的多核苷酸。
15.根据权利要求14所述的多种杆状病毒载体，其中所述第二杆状病毒载体包含编码Rep78和Rep52的多核苷酸序列。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的多种杆状病毒载体，其中编码所述Rep蛋白的所述多核苷酸序列与用于在昆虫细胞中表达所述Rep蛋白的启动子可操作地连接。
17.一种昆虫细胞，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的核酸。
18.一种昆虫细胞，其包含根据权利要求12所述的杆状病毒载体或根据权利要求13至16中任一项所述的多种杆状病毒载体。
19.根据权利要求17或18所述的昆虫细胞，其中编码AAV病毒衣壳蛋白的多核苷酸序列和编码Rep蛋白的多核苷酸序列由所述昆虫细胞内的附加体复制的重组杆状病毒基因组表达。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的昆虫细胞，其中编码由AAV反向末端重复(ITR)序列侧接的目的蛋白质或RNA的多核苷酸由所述昆虫细胞内的附加体复制的重组杆状病毒基因组表达。
21.一种在昆虫细胞中产生腺相关病毒(AAV)的方法，其包括：
在足以使所述细胞产生AAV的条件下在培养基中培养根据权利要求17至20中任一项所述的昆虫细胞；并任选地
从所述培养基和/或细胞中回收所述AAV。
22.一种在昆虫细胞中产生腺相关病毒(AAV)的方法，其包括：
(i)用以下对昆虫细胞进行共感染：第一杆状病毒，其基因组包含根据权利要求8至11中任一项所述的核酸分子；和第二杆状病毒，其基...
【专利技术属性】
技术研发人员：V·斯特林斯乌福姆巴，SC·高，P·W·罗尔文克，
申请(专利权)人：贝尼泰克生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU
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