用于单分子测序样品制备的环化方法技术

本发明专利技术是经由夹板连接而制备和使用文库诸如单链环状核酸模板的测序文库的新型方法。

Cyclization method for sample preparation of single molecule sequencing

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于单分子测序样品制备的环化方法专利
本专利技术涉及核酸分析领域，且更具体地，涉及制备用于核酸测序的环状模板。专利技术背景环状核酸模板在核酸分析中具有多种应用。将线性核酸转化成环状形式用于扩增(例如，通过滚环扩增(RCA))和随后的检测和定量，参见美国专利号RE44265。环状模板在测序中的应用也是本领域已知的。参见美国专利号7,302,146和8,153,375。这些策略产生包含靶标核酸的两条链的环状模板。本专利技术是产生适合用于测序的模板的文库的新型的有效方法，所述模板包含来自靶标核酸的每条链的环状单链分子。所述方法允许制备基本上不受限长度的模板。专利技术概述本专利技术是形成用于核酸测序的环状核酸分子或环状分子的文库的方法。在一些实施方案中，本专利技术是由靶标核酸形成环状分子的方法，其包括：将衔接子序列附接至所述靶标核酸的末端以形成衔接的靶标核酸；使所述衔接的靶标核酸与双链主链核酸接触；在所述主链和所述衔接的靶标核酸二者中产生单链突出端；使所述主链的单链突出端与所述衔接的靶标核酸的单链突出端杂交；将所述主链的末端与所述衔接的靶标核酸的末端连接以形成环状分子。在一些实施方案中，通过连接将所述衔接子附接至所述靶标核酸的末端。在其他实施方案中，通过延伸在5'-部分中包含衔接子序列的靶标特异性双组分引物，将所述衔接子附接至所述靶标核酸的末端。所述衔接的靶标核酸在与所述主链接触之前被扩增。在一些实施方案中，所述衔接子和所述主链包含互补的末端序列。通过核酸酶消化产生单链突出端。所述主链和衔接子序列包含外切核酸酶核酸酶抗性修饰，诸如具有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在连接之前的步骤中的聚合酶填充。在一些实施方案中，本专利技术是对靶标核酸进行测序的方法，其包括由如本文所述的靶标核酸形成环状分子。所述方法可以包括以下步骤：将衔接子序列附接至所述靶标核酸的末端以形成衔接的靶标核酸；使所述衔接的靶标核酸与双链主链核酸接触；在所述主链和所述衔接的靶标核酸二者中产生单链突出端；使所述主链的单链突出端与所述衔接的靶标核酸的单链突出端杂交；将所述主链的末端与所述衔接的靶标核酸的末端连接以形成环状分子；分离所述环状分子的链以产生单链环状分子；和使测序引物与所述单链环状分子中的每一者退火；延伸退火的测序引物，由此对所述靶标核酸进行测序。所述衔接子可以包含测序引物结合位点和至少一个条形码。在一些实施方案中，所述主链包含至少一个条形码。所述核酸的链可以通过如下分离：热或化学手段，或通过将一条链切口并通过外切核酸酶消化除去带切口的链，例如，如果所述主链包含至少一个脱氧尿嘧啶并且使所述样品接触尿嘧啶-N-DNA糖基化酶。在一些实施方案中，所述主链包含用于捕获部分的配体，并且所述连接的环状分子的一条链被捕获在固体支持物上。在一些实施方案中，所述测序利用链置换DNA聚合酶。在一些实施方案中，所述测序利用纳米孔装置。在一些实施方案中，所述方法在连接步骤之后还包括纯化步骤。附图简述图1显示产生用于测序的环状模板的现有技术策略。图2显示所述方法的步骤1：连接具有测序引物位点的通用衔接子。图3显示所述方法的替代步骤1：用具有测序引物位点的标记的基因特异性引物进行扩增。图4显示所述方法的步骤2：外切核酸酶消化和环化。图5显示所述方法的替代步骤2：使用吉布森组装进行环化。图6显示所述方法的替代步骤2：使用吉布森组装进行环化并在固体支持物上进行捕获。图7显示所述方法的替代步骤1：连接不具有测序引物位点的通用衔接子。图8显示所述方法的替代步骤1：用不具有测序引物位点的标记的基因特异性引物进行扩增。图9显示所述方法的替代步骤2：使用吉布森组装进行环化，其中主链包含测序引物位点。详述定义以下定义辅助本公开内容的理解。术语“样品”是指含有或假定含有靶标核酸的任何组合物。这包括从个体分离的组织或流体的样品，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪水、血细胞、器官和肿瘤，并且也是指从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)和从其分离的核酸。样品还可以包括无细胞材料，诸如含有无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤DNA(ctDNA)的无细胞血液级分。术语“核酸”是指核苷酸(例如，天然的和非天然的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合物，包括DNA、RNA及其亚类，诸如cDNA、mRNA等。核酸可以是单链的或双链的，且通常含有5'-3'磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可能具有其他键。核酸可以包括天然存在的碱基(腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)以及非天然碱基。非天然碱基的一些实例包括在例如Seela等人,(1999)Helv.Chim.Acta82:1640中描述的那些。非天然碱基可以具有特定功能，例如，增加核酸双链体的稳定性、抑制核酸酶消化或阻断引物延伸或链聚合。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。多核苷酸是单链或双链核酸。寡核苷酸是有时用于描述较短多核苷酸的术语。通过本领域已知的任意合适方法制备寡核苷酸，例如，通过涉及直接化学合成的方法，如以下文献中所述：Narang等人(1979)Meth.Enzymol.68:90-99；Brown等人(1979)Meth.Enzymol.68:109-151;Beaucage等人(1981)TetrahedronLett.22:1859-1862;Matteucci等人(1981)J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191。术语“引物”是指与靶标核酸中的序列(“引物结合位点”)杂交且能够在适合这种合成的条件下充当沿着核酸的互补链的合成的起始点的单链寡核苷酸。术语“衔接子”意指可以被添加至另一个序列以便将额外的特性输入该序列的核苷酸序列。衔接子通常是这样的寡核苷酸：其可以是单链或双链的，或者可以同时具有单链部分和双链部分。术语“连接”是指接合两条核酸链的缩合反应，其中一个分子的5'-磷酸酯基团与另一个分子的3'-羟基基团反应。连接通常是由连接酶或拓扑异构酶催化的酶促反应。连接可以接合两条单链以产生一个单链分子。连接还可以接合两条链(每条链属于一个双链分子)，因此接合两个双链分子。连接还可以将双链分子的两条链接合至另一个双链分子的两条链，因此接合两个双链分子。连接还可以接合在双链分子内的链的两个末端，因此修复双链分子中的切口。术语“条形码”是指可以检测和标识的核酸序列。可以将条形码并入多种核酸中。条形码是足够长的，例如2、5、20个核苷酸，使得在样品中，可以将并入条形码的核酸根据所述条形码区分或分组。术语“多重标识符”或“MID”是指标识靶标核酸的来源(例如，衍生出核酸的样品)的条形码。来自相同样品的所有或基本上所有的靶标核酸将共享相同的MID。可以将来自不同来源或样品的靶标核酸混合并同时测序。使用MID，可以将序列读出分配至靶标核酸所起源的各个样品。术语本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.由靶标核酸形成环状分子的方法，其包括：/na) 将衔接子序列附接至所述靶标核酸的末端以形成衔接的靶标核酸；/nb) 使所述衔接的靶标核酸与双链主链核酸接触；/nc) 在所述主链和所述衔接的靶标核酸二者中产生单链突出端；/nd) 使所述主链的单链突出端与所述衔接的靶标核酸的单链突出端杂交；/ne) 将所述主链的末端与所述衔接的靶标核酸的末端连接以形成环状分子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171006 US 62/5694751.由靶标核酸形成环状分子的方法，其包括：
a)将衔接子序列附接至所述靶标核酸的末端以形成衔接的靶标核酸；
b)使所述衔接的靶标核酸与双链主链核酸接触；
c)在所述主链和所述衔接的靶标核酸二者中产生单链突出端；
d)使所述主链的单链突出端与所述衔接的靶标核酸的单链突出端杂交；
e)将所述主链的末端与所述衔接的靶标核酸的末端连接以形成环状分子。


2.权利要求1的方法，其中通过连接将所述衔接子附接至所述靶标核酸的末端。


3.权利要求1的方法，其中通过延伸在5'-部分中包含衔接子序列的靶标特异性双组分引物，将所述衔接子附接至所述靶标核酸的末端。


4.权利要求3的方法，其中在步骤b)之前扩增所述衔接的靶标核酸。


5.权利要求1-4的方法，其中所述衔接子和所述主链包含互补的末端序列。


6.权利要求1-5的方法，其中通过核酸酶消化产生单链突出端。


7.权利要求1-6的方法，其中所述主链和衔接子序列包含外切核酸酶核酸酶抗性修饰，尤其是硫代磷酸酯键。


8.权利要求1-7的方法，其进一步包括在步骤d)和e)之间的步骤中的聚合酶填充。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：JA约翰逊，U施莱希特，D阮，M乔治，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH