【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种扩增TCR全长序列的PCR引物及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种扩增TCR全长序列的PCR引物及其应用，具体涉及一种扩增TCR全长序列的PCR引物，扩增TCR全长序列的方法及其应用。
技术介绍
T淋巴细胞前体从骨髓进入胸腺，经历阳性和阴性筛选过程，发育为成熟的T细胞。期间，T细胞获得功能性T细胞受体(T cell receptor，TCR)，表达成熟T细胞的表面分子(CD4/CD8等)且获得MHC限制性和自身耐受性。T细胞种类复杂多样性与TCR重排相关，在胸腺中，TRB(TCRβ)基因经过D-J，V-D-J，V-D-J-C区域重排，最终产生约108不同TRB重排基因；TRA(TCRα)基因经过V-J，V-J-C区域重排，最终产生约104不同TRA重排基因。在人体外周血中，TCR多样性由于TRB、TRA的重排多达1018，决定着人的免疫系统如何适应环境的变化。目前，对TCR的主要鉴别方法之一是对α和β链进行测序。传统免疫学研究中，基于群体细胞测序获得的数据很难实现对细胞异质性和不同细胞亚群的特性分析。现有技术...
【技术保护点】
一种扩增TCR全长序列的PCR引物对，其包括上游引物和下游引物；/n所述上游引物为根据一段接头序列设计的引物，所述接头序列引入到第一链cDNA的3’端；/n所述下游引物为根据TCR的C区设计的下游引物。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种扩增TCR全长序列的PCR引物对，其包括上游引物和下游引物；
所述上游引物为根据一段接头序列设计的引物，所述接头序列引入到第一链cDNA的3’端；
所述下游引物为根据TCR的C区设计的下游引物。
根据权利要求1所述的PCR引物对，其特征在于，所述接头序列是利用接头引物通过转换模板法引入。
根据权利要求1或2所述的PCR引物对，其特征在于，所述接头序列的长度为18-35nt。
根据权利要求3所述的PCR引物对，其特征在于，所述接头序列的长度为28nt。
根据权利要求1-4任一项所述的PCR引物对，其特征在于，所述接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述下游引物根据TCR的C区的5’端或3’端进行设计；
优选地，所述下游引物为巢式引物；
优选地，所述下游引物包括外部引物、中间引物或内部引物中的任意一种或至少两种的组合，优选为外部引物、中间引物或内部引物的组合。
根据权利要求1-5任一项所述的PCR引物对，其特征在于，所述TCR全长由TCRα基因全长和TCRβ基因全长组成或由TCRγ基因全长和TCRδ基因全长组成；
优选地，扩增TCRα基因全长的下游引物的外部引物、中间引物和内部引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
优选地，扩增TCRα基因全长的下游引物的外部引物、中间引物和内部引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
优选地，扩增TCRβ基因全长的下游引物的外部引物、中间引物和内部引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；
优选地，扩增TCRβ基因全长的下游引物的外部引物、中间引物和内部引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
一种扩增TCR全长序列的方法，其使用如权利要求1所述的PCR引物对，其特征在于，包括如下步骤：
(1)裂解细胞；
(2)将得到的mRNA进行反转录，得到第一链cDNA；
(3)以步骤(2)得到的第一链cDNA为模板，以权利要求1所述PCR引物对中的上游引物和下游引物进行PCR扩增；
(4)测序验证，得到所述TCR的全长序列。
根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的mRNA反转录的体系包括接头序列。
根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述接头序列的终浓度为0.5-2μM，优选为1μM；
优选地，步骤(2)所述的mRNA反转录的条件为：42℃ 90min 1循环；50℃ 2min，42℃ 2min，10循环；70℃ 15min 1循环；保存在4℃。
根据权利要求7-9任一项所述的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，周清，王磊，吴靓，赵正琦，杨乃波，李贵波，侯勇，李波，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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