一种扩增TCR全长序列的PCR引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种扩增TCR全长序列的PCR引物对及其制备方法和应用，包括上游引物和下游引物：所述上游引物根据一段接头序列设计，所述接头序列通过接头引物TSO引入到第一链cDNA的3’端；所述下游引物根据TCR的C区设计。

PCR primer for amplification of TCR full-length sequence and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种扩增TCR全长序列的PCR引物及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种扩增TCR全长序列的PCR引物及其应用，具体涉及一种扩增TCR全长序列的PCR引物，扩增TCR全长序列的方法及其应用。
技术介绍
T淋巴细胞前体从骨髓进入胸腺，经历阳性和阴性筛选过程，发育为成熟的T细胞。期间，T细胞获得功能性T细胞受体(T cell receptor，TCR)，表达成熟T细胞的表面分子(CD4/CD8等)且获得MHC限制性和自身耐受性。T细胞种类复杂多样性与TCR重排相关，在胸腺中，TRB(TCRβ)基因经过D-J，V-D-J，V-D-J-C区域重排，最终产生约108不同TRB重排基因；TRA(TCRα)基因经过V-J，V-J-C区域重排，最终产生约104不同TRA重排基因。在人体外周血中，TCR多样性由于TRB、TRA的重排多达1018，决定着人的免疫系统如何适应环境的变化。目前，对TCR的主要鉴别方法之一是对α和β链进行测序。传统免疫学研究中，基于群体细胞测序获得的数据很难实现对细胞异质性和不同细胞亚群的特性分析。现有技术中目前采用的具体实验技术如：(1)MμLtiplex PCR联合高通量测序技术，通过设计覆盖所有TRA、TRB分型的多重引物，在群体中捕获尽量完整的TRA、TRB亚型，高通量测序读取每一个亚型的TRA、TRB序列；该技术采用在TCR V区设计多重PCR引物，如针对覆盖所有功能TRB重排基因V区的T细胞repertoire引物Vp1-Vp9，以及覆盖所有功能TRA重排基因V区的T细胞repertoire引物Vp1-Vp24，结合TCR恒定区C区引物，进行多重PCR扩增，该技术一般可以进行群体样本的TCR repertoire序列扩增，捕获多样性的TCR序列，后续通过联合高通量测序技术对T细胞多样性进行分析。但在不同T细胞亚型间，MμLtiplex PCR有一定的扩增偏好性，不能准确的得到TCRα/β配对序列信息。进一步在单细胞层面开发的MμLtiplex RT-PCR，可以一定程度的区分单细胞TCRα/β配对序列，是目前为数不多的一种单细胞TCRα/β配对扩增技术，但实验体系相对复杂，不易于实现高通量测序；(2)RACE(rapid-amplification of cDNA ends)联合高通量测序技术，通过TCR序列中恒定已知序列设计引物，在群体中扩增TCR基因序列，高通量测序技术读取每个亚型的TRA、TRB序列；基于PCR技术基础上由已知一段cDNA序列，设计5’和3’RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2)，通过往两端延伸扩增而获得完整的3’和5’端的方法。由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。该技术应用于T细胞TCR扩增，一般设计TRA或TRB重排基因恒定区C区引物，通过5’RACE扩增TCR基因5’端的序列，通过高通量测序技术，从而解读TCR序列。该技术通常用于群体样本T细胞多样性分析，起始样本量较高，对于低丰度的T细胞亚群较难捕获。(3)群体高通量测序：DNA条形码结合高通量测序技术是在96孔板中培养具有明显亚群的T细胞，针对不同T细胞亚群的TCR进行扩增。在高通量测序过程中，特异性的DNA条形码与扩增产物结合，同时读取TCR序列信息和DNA条形码信息，通过DNA条形码信息确定TCR对应的孔来源。然而，该技术方案样本处理流程复杂，需要预先对T细胞进行分群，且测序结果不能准确模拟α/β配对信息。(4)TraCeR是一种开放型分析工具(Michael J.T.Stubbington等，(2016)Nature Methods，DOI：10.1038/NMETH.3800)，用于分析T细胞单细胞全转录组序列，通过计算机技术重构全长TCR α/β配对序列，揭示T细胞功能特异性。单细胞全转录组数据可以揭示细胞之间的转录异质性和不同细胞之间的演化进程，从而推算出T细胞亚群类型。该技术结合单细胞转录组数据，获得重组的TCR的α/β配对序列信息，具有较高的优势和创新，但是计算机重构的TCR序列的完整性和准确性仍有待于提高。这些技术无法准确区分T细胞TCR亚群及TCRα/β配对关系，而要进一步理解T细胞反应机理，需要对不同T细胞亚群内部和相互间的表型差异进行更精确的识别。因此，在单细胞水平进行免疫细胞分析越来越广泛被应用于免疫学研究中。然而，目前没有十分有效的技术可以在单细胞层面实现TCRα/β配对测序，且覆盖已知的所有TRA、TRB亚型。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种扩增TCR全长序列的PCR引物及其应用，以实现TCR序列的全长扩增并获得TCR中α/β亚基的配对信息，解决了现有其他方法起始样本量高、TCR亚型覆盖不完整和偏好性扩增、TCR序列扩增不完整等缺点，真正意义上的实现人单个T细胞层面的TCR序列全长扩增。第一方面，本专利技术提供了一种扩增TCR全长序列的PCR引物对，包括上游引物和下游引物；所述上游引物为根据一段接头序列设计的引物，所述接头序列引入到第一链cDNA的3’端；所述下游引物为根据TCR的C区设计的下游引物。本专利技术中，TCR的抗原结合位极为多样化，产生这种多样性的机理主要源于免疫球蛋白基因的V(D)J重组，编码免疫球蛋白的基因位点由许多基因片段构成，包括可变段(V)、连接段(J)以及之间可能存在的多样段(D)，α亚基由VJ重组产生，β亚基则由VDJ重组产生，其中J与恒定区(C)相连，尽管TCR具有种类多样性，但是其C区序列同源性较好，所以本专利技术将下游引物根据C区进行设计，可以在C区的5’端到3’端中的任意位置进行设计，再通过在TCR的3’端加入一段接头序列，同时根据其设计上游引物，通过这样的上游和下游引物就可以获得完整的V(D)J序列，从而得到TCR全长。本专利技术中，所述设计引物遵循一般引物设计原则，例如GC含量40-60％、无二级发夹结构、无引物二聚体等，引物设计应该尽量设计在没有碱基多态性的位置。根据本专利技术，所述上游引物的长度为18-28nt，例如可以是18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt或28nt，优选为23nt。根据本专利技术，所述接头序列是利用接头引物通过转换模板法引入的，所述上游引物是根据所述接头序列设计的，其中所述接头引物可以是任意一段固定长度的序列，本领域技术人员可以根据需要进行设计，本专利技术的接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列如下：本专利技术的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：根据本专利技术，所述下游引物根据TCR的C区的5’端或3’端进行设计，由于后期测序的平台主要是Miseq测序平或Sanger测序平台，针对Miseq测序平台，因为最大读长只本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增TCR全长序列的PCR引物对，其包括上游引物和下游引物；/n所述上游引物为根据一段接头序列设计的引物，所述接头序列引入到第一链cDNA的3’端；/n所述下游引物为根据TCR的C区设计的下游引物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种扩增TCR全长序列的PCR引物对，其包括上游引物和下游引物；
所述上游引物为根据一段接头序列设计的引物，所述接头序列引入到第一链cDNA的3’端；
所述下游引物为根据TCR的C区设计的下游引物。


根据权利要求1所述的PCR引物对，其特征在于，所述接头序列是利用接头引物通过转换模板法引入。


根据权利要求1或2所述的PCR引物对，其特征在于，所述接头序列的长度为18-35nt。


根据权利要求3所述的PCR引物对，其特征在于，所述接头序列的长度为28nt。


根据权利要求1-4任一项所述的PCR引物对，其特征在于，所述接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述下游引物根据TCR的C区的5’端或3’端进行设计；
优选地，所述下游引物为巢式引物；
优选地，所述下游引物包括外部引物、中间引物或内部引物中的任意一种或至少两种的组合，优选为外部引物、中间引物或内部引物的组合。


根据权利要求1-5任一项所述的PCR引物对，其特征在于，所述TCR全长由TCRα基因全长和TCRβ基因全长组成或由TCRγ基因全长和TCRδ基因全长组成；
优选地，扩增TCRα基因全长的下游引物的外部引物、中间引物和内部引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

优选地，扩增TCRα基因全长的下游引物的外部引物、中间引物和内部引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
优选地，扩增TCRβ基因全长的下游引物的外部引物、中间引物和内部引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；
优选地，扩增TCRβ基因全长的下游引物的外部引物、中间引物和内部引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。


一种扩增TCR全长序列的方法，其使用如权利要求1所述的PCR引物对，其特征在于，包括如下步骤：
(1)裂解细胞；
(2)将得到的mRNA进行反转录，得到第一链cDNA；
(3)以步骤(2)得到的第一链cDNA为模板，以权利要求1所述PCR引物对中的上游引物和下游引物进行PCR扩增；
(4)测序验证，得到所述TCR的全长序列。


根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的mRNA反转录的体系包括接头序列。


根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述接头序列的终浓度为0.5-2μM，优选为1μM；
优选地，步骤(2)所述的mRNA反转录的条件为：42℃ 90min 1循环；50℃ 2min，42℃ 2min，10循环；70℃ 15min 1循环；保存在4℃。


根据权利要求7-9任一项所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，周清，王磊，吴靓，赵正琦，杨乃波，李贵波，侯勇，李波，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44