评估抗体-药物缀合物的方法技术

本公开提供了评估ADC产品的DAR的方法，这些方法提供相对于已知方法的优势。具体地，本公开的方法可以在高通量的应用中和/或在评估期间无需稀释ADC样品的情况下使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】评估抗体-药物缀合物的方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年9月8日提交的美国临时专利申请号62/556,153的优先权，该临时专利申请的内容通过引用并入本文。
技术介绍
抗体-药物-缀合物(ADC)是一类新兴的药物分子。它们定位到特异性靶标并递送有效药物的能力使其成为开发基于靶标的治疗产品的有吸引力的选择。ADC是通过将有效药物分子与单克隆抗体化学接头来产生的。与单克隆抗体缀合的药物分子的平均数量称为药物与抗体之比(“DAR”)。DAR是ADC产品的重要质量属性，因为它会影响产品的功效、安全性和/或稳定性。因此，以可靠且高通量的方式评估ADC产品的DAR的方法是可取的。具体实施方式本公开提供了评估ADC产品的DAR的方法，这些方法提供相对于已知方法的优势。具体地，本公开的方法可以在高通量的应用中和/或在评估期间无需稀释ADC样品的情况下使用。紫外-可见(UV-Vis)和比尔-朗伯(Beer-Lambert)定律DAR传统上是使用UV-Vis光谱法测量的(参见例如，Chen,MethodsMol.Biol.1045:267-73(2013))。该分析的基础是比尔-朗伯定律，即物质的吸光度与浓度之间的正比关系：A＝εcl，其中A是吸光度，ε是消光系数(物质的物理常数)，l是穿过含有细胞的分析物的路径长度，并且c是浓度。使用UV-Vis光谱法对ADC产品进行DAR测量依赖于抗体的最大吸收(例如，280nm)与药物的最大吸收(例如，252nm)之差。例如，平均DAR可以使用缀合材料在280nm和252nm处测量的吸收的差来计算。尽管UV-Vis方法已在工业中广泛使用，但它缺少进行配制筛选研究所需的通量。它在不进行样品稀释的情况下无法使用，从而导致与样品稀释有关的误差。因此，本公开至少部分地基于使用尺寸排阻色谱法(例如，UPLC)和斜率光谱法测量DAR的替代方法。对这些方法进行了表征，并在再现性、精密度和灵敏度方面与UV-Vis光谱法进行了比较。生成的数据支持使用基于UPLC的DAR方法来克服传统UV-Vis方法的通量限制。此外，基于斜率光谱法的方法可用于在不进行样品稀释的情况下分析ADC样品。基于UPLC的方法在一个实施方案中，尺寸排阻用于确定DAR。在一些实施方案中，本文公开的方法包括将包含抗体-药物缀合物的样品施加于尺寸排阻色谱基质。在一些实施方案中，本文公开的方法包括施加包含抗体-药物缀合物的样品并通过尺寸排阻色谱基质运行包含抗体-药物缀合物的样品。在一些实施方案中，将ADC样品的总量施加于尺寸排阻基质以进行分析。例如，以下基于UPLC的方法用于评估DAR。使用Empower的ApexTrack积分方法以及峰肩检测对280nm处收集的数据进行积分。保留时间积分范围因分子而异，但通常在3-9分钟内。具有最大高度和面积的峰被归类为“天然”、“主”或“单体”峰。早于“天然”峰洗脱的任何峰均归类为“HMW”峰。晚于“天然峰”洗脱的任何峰均归类为“LMW”峰。从各个峰的面积与所有峰的总面积之比计算每个种类的相对百分比。以下的相对百分比面积报告为纯度的指标：总HMW％、天然(或主或单体)天然％或总LMW％。对所有峰的总面积求和并用于随后的DAR计算中。然而，在一些实施方案中，仅使用天然峰的面积。使用Empower的ApexTrack积分方法以及峰肩检测对252nm处收集的数据进行了积分。保留时间积分范围因分子而异，但通常在3-9分钟内。对所有峰的总面积求和并用于随后的DAR计算中。然而，在一些实施方案中，仅使用天然峰的面积。DAR是由280nm处的总峰面积(ADC的Amax)和252nm处的总峰面积(药物的Amax)来确定。尽管对于用于ADC的药物缀合物来说252nm是常见的Amax，但是可以例如使用已知方法为特定的缀合物选择适当的波长。如果适用，可以使用裸抗体作为参考标准品，通过这两个波长处的总峰面积之差来确定与抗体结合的药物的量。以下两个公式(从比尔-朗伯定律推导出来)已被验证并证明为具有一致性。公式1：公式1不需要使用裸抗体参考标准品。然而，需要系统性确定抗体和药物二者在252nm处的消光系数(ε)。给定波长处的消光系数可以由比尔-朗伯定律通过使用已知浓度的抗体或药物的溶液并测量给定波长处的吸光度容易地计算。公式2：公式2不需要对252nm处的抗体进行消光系数确定，但确实需要收集裸抗体参考标准品的UPLC数据。尽管已经举例说明了UPLC，但是在本文描述的方法中可以使用其他尺寸排阻色谱技术。尺寸排阻色谱法通常是指按尺寸分离分子，其中色谱洗脱时间对于特定分子是特征性的。另外的方法包括例如SEC-HPLC、反相(RP)HPLC、RP-UPLC。在一些实施方案中，在通过尺寸排阻色谱法(例如HPLC或UPLC)进行分析之前，不稀释ADC样品。在一些实施方案中，在通过尺寸排阻色谱法进行分析之前ADC样品不需要进行稀释，因为将ADC样品的总量施加于尺寸排阻色谱基质。在一些实施方案中，分析含有约1μg/μL至约500μg/μLADC的样品。基于斜率光谱法的方法在一些实施方案中，DAR是通过计算ADC样品中抗体和药物的浓度来确定。例如，斜率光谱法是用于确定各种路径长度下溶液的吸光度的已知方法。然后可以基于比尔-朗伯定律使用各种路径长度下的吸光度值来计算溶液中化合物的浓度。采用斜率光谱法的方法和系统是已知的(参见例如，美国公开号20120130649)和可商购的(参见例如，SoloVPE(CTechnologies,Inc.,Bridgewater,NJ))。此类方法和系统适用于测量ADC制剂中抗体和药物的浓度，从而确定DAR。例如，可以将ADC样品放置在容器中；可以使探针相对于容器移动，使得探针与容器的底部接触；可以使探针相对于容器移动，使得探针从容器的底部穿过样品以预定的增量移动，从而获得通过溶液的预先选择的路径长度；可以在抗体的最大吸收处读取吸光度读数；可以使探针相对于样品反复移动，并可以进行测量；可以从吸光度和路径长度生成回归线，从而获得回归线的斜率；并且可以通过将回归线的斜率除以抗体的消光系数来确定抗体的浓度。然后可以使用药物的最大吸收来重复这些步骤，以确定药物的浓度。DAR可以由确定的药物浓度和抗体浓度来计算。在一些实施方案中，在通过斜率光谱法进行分析之前，不稀释ADC样品。在一些实施方案中，分析含有约0.1μg/μL至约500μg/μLADC的样品。抗体-药物缀合物如本文所用，术语“抗体-药物缀合物”是指通过将抗体与生物活性细胞毒性有效载荷或药物连接而产生的蛋白质。抗体-药物缀合物(ADC)是通常通过本领域技术人员已知的化学修饰/偶联反应产生的。可以使用本文描述的方法分析任何抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包括抗肿瘤抗体(参见例如，Adler等人,Hematol.Oncol.Cl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定包含抗体-药物缀合物的样品中药物与抗体之比(DAR)的方法，其包括：/n将所述样品施加于尺寸排阻色谱基质；/n检测所述样品在第一光波长(λ1)处的吸光度，其中所述第一波长是所述抗体的预定吸光度最大值；/n检测所述样品在第二光波长(λ2)处的吸光度，其中所述第二波长是所述药物的预定吸光度最大值；/n确定所述样品在所述第一和第二波长处的总吸光度；以及，/n使用以下公式1计算DAR：/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170908 US 62/5561531.一种确定包含抗体-药物缀合物的样品中药物与抗体之比(DAR)的方法，其包括：
将所述样品施加于尺寸排阻色谱基质；
检测所述样品在第一光波长(λ1)处的吸光度，其中所述第一波长是所述抗体的预定吸光度最大值；
检测所述样品在第二光波长(λ2)处的吸光度，其中所述第二波长是所述药物的预定吸光度最大值；
确定所述样品在所述第一和第二波长处的总吸光度；以及，
使用以下公式1计算DAR：



其中是所述抗体在所述第一波长处的消光系数；是所述抗体在所述第二波长处的消光系数；是所述药物在所述第一波长处的消光系数；是所述药物在所述第二波长处的消光系数；总面积λ1是所述样品在所述第一波长处的总吸光度；并且总面积λ2是所述样品在所述第二波长处的总吸光度。


2.一种确定包含抗体-药物缀合物的样品中药物与抗体之比(DAR)的方法，其包括：
通过以下方法测量包含所述抗体-药物缀合物的样品的总吸光度：
将包含所述抗体-药物缀合物的样品施加于尺寸排阻色谱基质；
检测所述样品在第一光波长(λ1)处的吸光度，其中所述第一波长是所述抗体的预定吸光度最大值；
检测所述样品在第二光波长(λ2)处的吸光度，其中所述第二波长是所述药物的预定吸光度最大值；
确定所述样品在所述第一和第二波长处的总吸光度；
通过以下方法测量包含所述抗体的样品的总吸光度：
将包含所述抗体的样品施加于尺寸排阻色谱基质；
检测包含所述抗体的样品在所述第一光波长(λ1)处的吸光度；
检测包含所述抗体的样品在所述第二光波长(λ2)处的吸光度；以及
确定包含所述抗体的样品在所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：A斯金纳，N库利巴，
申请(专利权)人：里珍纳龙药品有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US