一种预防雏鹅痛风的鹅星状病毒二价灭活疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，包含有灭活的两种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为新型鹅星状病毒GD株和保藏编号为CCTCC NO:V201976的鹅星状病毒变异毒SC‑3株。本发明专利技术所提供的二价灭活疫苗能够对当前我国流行的雏鹅痛风病起到很好的预防作用，从而减少养殖业的损失。

A bivalent inactivated vaccine against Gosling gout

【技术实现步骤摘要】
一种预防雏鹅痛风的鹅星状病毒二价灭活疫苗
本专利技术属于禽类疫苗制备
，具体涉及一种预防雏鹅痛风的鹅星状病毒二价灭活疫苗。
技术介绍
自2015年以来，我国广大养鹅地区出现了一种以痛风为主要特点的传染性疾病，该病主要发生于5-15日龄雏鹅，造成20％～30％的死亡率，饲养条件差的高达40％，发病日龄越小，死亡率越高，15日龄以后基本无死亡，死亡雏鹅主要表现为全身各脏器和关节的严重尿酸盐沉积，耐过鹅往往由于消化吸收障碍导致饲料转化率低下，机体发育不良，大群生长参差不齐，严重影响鹅群生产成绩，给我国的养鹅业造成了重大损失。经病原分离与鉴定确诊了雏鹅痛风主要是由两种基因型的鹅星状病毒所引起。目前，我国没有针对鹅星状病毒的疫苗，因此，筛选鹅星状病毒并制备疫苗对于雏鹅痛风病的防控具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，从而填补我国没有鹅星状病毒疫苗的空白。本专利技术提供一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，包含有灭活的两种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为鹅星状病毒GD株(鹅星状病毒，购自中国兽医药品监察所)和保藏编号为CCTCCNO:V201976的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株；其中这两种病毒株的病毒含量不低于2×106.0TCID50/0.1ml；其中病毒株是使用甲醛溶液进行灭活。所述的疫苗佐剂为油相佐剂，其一种组成是94份兽用白油，1份硬脂酸铝、5份司本-80。本专利技术的二价灭活疫苗，其制备方法如下：1)病毒增殖及收获：将GD株在LMH细胞上进行病毒增殖，将SC-3株在鹅胚绒毛尿囊膜上进行病毒繁殖，获得病毒液；2)病毒的浓缩：将收获的2种病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩2倍，浓缩的病毒液准备进行灭活；3)病毒灭活：将浓缩的病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％；37℃摇床内，200rpm震荡灭活20小时后取出，放2～8℃保存；4)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－805份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；5)水相制备将步骤3)灭活的鹅星状病毒GD株和SC-3株抗原液各96份分别与灭菌后的4份吐温-80混合，在水相制备罐中搅拌至吐温-80完全溶解；6)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min进行乳化制成疫苗。本专利技术所提供的二价灭活疫苗能够对当前我国流行的雏鹅痛风病起到很好的预防作用，从而减少养殖业的损失。附图说明图1：不同方式攻毒后的解剖图；图2：不同攻毒组鹅只的泄殖腔拭子病毒基因RT-PCR检测图，每组随机抽样检测了11只，M泳道：Marker，“N”代表阴性对照；图3：不同免疫组攻毒后鹅泄殖腔拭子病毒基因RT-PCR检测图，其中1-20泳道分别代表鹅只编号，阳性目的条带切胶后测序鉴定均为鹅星状病毒序列；M泳道：Marker；攻毒后第2、4、6、8、10、12天的排毒情况与攻毒后第14天一致；图4：免疫和非免疫种鹅所产种蛋孵化的雏鹅攻毒后解剖图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：1、病毒株的分离及鉴定本专利技术使用了2株鹅星状病毒，其中鹅星状病毒FLX变异病毒SC-3株，已于2019年10月29日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201976；其中鹅星状病毒FLX变异病毒SC-3株是从2017年10月至2019年5月期间从广东、四川、河北、山东、安徽、辽宁等地送检的5-15日龄病、死雏鹅样品中分离的，该分离株对鹅胚是有较强致病力的，因此使得病鹅出现了不同于经典株引起的临床表现，主要表现为全身各脏器的严重尿酸盐沉积现象，这说明本专利技术分离到的鹅星状病毒的生物学特性较经典株发生了明显改变，尤其是对鹅胚的致病力以及对鹅引起的临床症状上，差异明显。鹅星状病毒FLX变异病毒SC-3株的基因组全长7288bp，而经典鹅星状病毒基因组全长7299bp(序列号：KY271027)，两株病毒全基因组、ORF1a基因、ORF1b基因以及ORF2基因序列均出现了不同程度的碱基突变或缺失，其中ORF1a基因高度保守，ORF1b基因相对保守，但编码病毒保护性抗原的衣壳蛋白ORF2基因(4869-6992)变化较大，发生了较大的碱基突变或缺失，进而造成翻译的氨基酸改变。中和实验表明，SC-3株阳性血清与YB-1株阳性血清对自身的中和能力较强，但对彼此的中和能力较差，两者的抗原相关性R值只有0.22(表4)，属于不同的血清型。本专利技术另一株鹅星状病毒购自中国兽医药品监察所，为方便叙述，说明书中将购自中国兽医药品监察所的鹅星状病毒命名为鹅星状病毒GD株。2、动物回归试验将本专利技术所使用的鹅星状病毒(新型鹅星状病毒GD株、鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株)分别在LMH细胞和鹅胚上进行病毒繁殖(繁殖方法见疫苗制备1.1病毒增殖及收获)，获得的病毒液用于动物回归试验，将健康的120只1日龄扬州白鹅均分为4组，30只/组，饲养在动物隔离器中，每日添加饲料和饮水，分别用新型鹅星状病毒GD株、鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株和新型鹅星状病毒GD株+鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株攻毒，攻毒剂量GD为106.0TCID50/0.1ml，SC-3为106.0ELD50/0.1ml，同时设立不攻毒的空白对照组，每日观察鹅群精神状态、采食及发病情况，并在攻毒后第2、4、6、8、10、12、14天采集每只鹅泄殖腔拭子，用RT-PCR的方法检测排毒情况，并记录试验数据。表1：雏鹅攻毒后的试验记录表动物回归试验结果表明，用单一的鹅星状病毒GD株或SC-3株攻毒，仅仅造成动物腹泻，但均不能复制出与临床发病一致的雏鹅痛风病，而用鹅星状病毒GD株和SC-3株联合攻毒成功复制出与临床发病一致的典型鹅痛风病(图1)，攻毒鹅的临床表现和排毒情况见表1和图2，因此，根据柯赫氏法则的定义，确定了引起雏鹅痛风病的病原为鹅星状病毒GD株和鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株两株病毒。实施例2：疫苗的制备及检测1、疫苗的制备1.1病毒增殖及收获将鹅星状病毒GD株、鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株分别在LMH细胞和鹅胚上进行病毒繁殖，以获得足量滴度高且纯净的病毒液。鹅星状病毒GD株：将LMH细胞在T25细胞瓶中传代培养，待细胞密度达到95％左右，倒掉瓶内细胞培养液，用无血清的DMEM培养基洗涤三次，按照1％剂量接种病毒，37℃吸附1h，期间每隔10min轻轻摇摆细胞瓶，以使病毒吸附完全，吸附完毕后倒掉接毒液，加入1％胎牛血清的DMEM培养基连续培养并观察，96h后细胞病变达到80％左右进行收毒，将细胞瓶放入-80℃超低温冰箱，反复冻融三次，使病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，其特征在于，所述的二价灭活疫苗包含有灭活的两种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为鹅星状病毒GD株和保藏编号为CCTCC NO:V201976的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株。/n

【技术特征摘要】
1.一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，其特征在于，所述的二价灭活疫苗包含有灭活的两种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为鹅星状病毒GD株和保藏编号为CCTCCNO:V201976的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株。


2.如权利要求1所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的病毒株的病毒含量不低于2×106.0TCID50/0.1ml。


3.如权利要求1或2所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的病毒株使用甲醛溶液进行灭活。


4.如权利要求1所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为油相佐剂。


5.如权利要求4所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的油相佐剂，其一种组成是94份兽用白油，1份硬脂酸铝、5份司本-80。


6.权利要求5所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的二价灭活疫苗的制备方法如下：
1)病毒增殖及收获：将...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉杰，刘东，刘红祥，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37