一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法与应用。所述荧光素标记的蛋白四聚体是通过荧光素标记的链霉亲和素结合生物素标记的目标蛋白而形成的。生物素标记的目标蛋白由HEK293细胞中重组表达，其N‑端或C‑端共表达一个Avi Tag，进而在BirA酶作用下，Avi Tag的赖氨酸残基被连接上一个生物素。将生物素标记的目标蛋白与荧光素标记的链霉亲和素混合反应获得荧光直标的蛋白四聚体。本发明专利技术的荧光直标的蛋白四聚体可用于流式筛选免疫检测点靶点蛋白的中和性抗体或CAR‑T细胞的阳性率检测，由于链霉亲和素与生物素起到级联放大作用，其检测灵敏度较其他方法制备的荧光素标的蛋白有很大提高。

A fluorescein labeled protein tetramer and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法与应用
本专利技术是关于一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法与应用，具体地说是关于一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法，以及其在筛选免疫检测点蛋白的中和性抗体或检测CAR-T细胞的阳性率中的应用。
技术介绍
近些年，以免疫检查点(ImmuneCheckpoint)抑制剂与CAR-T(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy)疗法所代表的癌症免疫治疗已经成为了多个肿瘤的一线治疗方案。PD-1抑制剂与CAR-T细胞治疗在多个癌症治疗中所展现出的惊人效果，也奠定了免疫治疗在肿瘤治疗中的新地位，特别是新兴的CAR-T细胞疗法，被誉为癌症治愈的新希望。目前已经批准上市的免疫检测点抑制剂主要以免疫检测点蛋白的中和性抗体为主，比如罗氏的Tecentriq、辉瑞的Bavencio、阿斯利康的Imfinzi等是针对免疫检测点蛋白PD-L1的抗体类药物，MSD的Keytruda、BMS的Opdive、再生元的Libtayo等是蛋白PD1的抗体药物，还有BMS的Yervoy是针蛋白CTLA-4的抗体药。这类抗体在研发过程中最常用的筛选方法就是用流式检测其在配体蛋白与受体蛋白结合中的作用。但是配体蛋白与受体蛋白之间的作用普遍较弱，所以筛选中和性抗体的检测窗口就比较小。CAR-T细胞疗法的原理是通过基因工程手段去修饰人的T细胞，使其细胞膜上表达嵌合抗原受体(chimericantigenrecetor,CAR)，CAR与肿瘤细胞表面的靶点蛋白结合后就会激活T细胞，以此增强T细胞对肿瘤的特异性杀伤作用。T细胞表面CAR的表达是CAR-T细胞制备过程必须检测的一个指标。常规检测CAR表达可选用proteinL蛋白和抗Fab段的抗体，但是proteinL只识别κ轻链类型的CAR，抗Fab段的抗体只识别CAR的Fab的结构，即使检测到CAR的表达，也不能检测出T细胞膜表面的CAR是否能够识别它的靶点抗原。只有用CAR相应的靶点抗原检测转染CAR的表达情况才是最有效的，但是用单体的CAR-T靶点蛋白检测灵敏度较差，尤其在CAR-T疗法的PK实验检测中。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种荧光素标记的蛋白四聚体。本专利技术的另一目的在于提供一种制备荧光素标记的蛋白四聚体的方法。本专利技术的另一目的在于提供荧光素标记的蛋白四聚体的应用。一方面，本专利技术提供了一种荧光素标记的蛋白四聚体，其是通过荧光素标记的链霉亲和素结合生物素标记的目标蛋白而形成的。其结构示意图见图1。相对比单体蛋白，本专利技术的蛋白四聚体应用于流式检测时具有操作简便、省时、灵敏度高等特点，原理对比示意图请参见图2。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光素标记的蛋白四聚体中，生物素标记的目标蛋白是由HEK293细胞重组表达的，其N-端或C-端共表达一个AviTag，在BirA酶作用下，AviTag的赖氨酸残基被连接上一个生物素，进而获得生物素标记的目标蛋白。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的这种四聚体蛋白包含两类，一类是免疫检测点类的荧光素标记的蛋白四聚体，主要用于建立一种灵敏度高，操作简便的筛选免疫检测点蛋白的中和性抗体的方法，另一类是CAR-T靶点类的荧光素标记的蛋白四聚体，主要用于建立高灵敏度高特异性的CAR-T细胞的阳性率检测方法。换而言之，本专利技术的荧光素标记的蛋白四聚体中，生物素标记的目标蛋白主要为免疫检测点蛋白或CAR-T靶点蛋白；优选地，免疫检测点蛋白包括PD1，PD-L1，CD80，CD86，CD28，CTLA-4，CD155，FGL1，LAG3，TIGIT，CD30L，CD30，CD40，CD4L，OX40，OX40L等一系列蛋白中的一种或多种；CAR-T靶点蛋白包括CD19，BCMA，MSLN，CD22，GCP3，CD20，PMSA等一系列蛋白中的一种或多种。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光素标记的蛋白四聚体中，生物素标记的目标蛋白是按照以下制备方法获得的：将AviTag基因连接到目标蛋白基因片段的N-端或者C-端，并构建其重组表达载体，然后将该载体质粒与BirA酶质粒共转染到HEK293细胞内，并在细胞培养基内添加生物素(biotin)，收集样品纯化后，获得生物素标记的目标蛋白。更具体地，其中，构建目标蛋白的重组表达载体是将目标蛋白基因和AviTag基因构建到运载体pcDNA3.1上；优选地，BirA酶表达载体构建时所用的运载体也为pcDNA3.1。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光素标记的蛋白四聚体中，荧光素标记的链霉亲和素可以为商品化的荧光素标记的链霉亲和素，例如，荧光素包括FITC，PE，APC，AlexaFlour染料等常用荧光素中的一种或多种。另一方面，本专利技术还提供一种制备所述的荧光素标记的蛋白四聚体的方法：其包括：将生物素标记的目标蛋白与荧光素标记的链霉亲和素按比例混合，在室温避光条件下反应，获得到荧光素标记的蛋白四聚体。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光素标记的蛋白四聚体的制备方法包括：将生物素化的目标蛋白与商品化的荧光素标记的链霉亲和素按4:1的摩尔比混合，充分混匀后在室温条件下，避光反应30分钟，获得荧光素标记的蛋白四聚体；所得荧光素标记的蛋白四聚体可进行分装，冻干并置于-80℃冰箱保存备用。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光素标记的蛋白四聚体的制备方法还包括生物素标记蛋白的制备：构建含有目标蛋白基因与AviTag基因的表达载体，测序无误后，扩增表达该载体质粒，与BirA酶质粒一起共转染到HEK293细胞中，37℃培养6-10天，收获细胞培养上清液，ProteinA亲和纯化，再经G25脱盐，得到纯化的生物素标记蛋白。根据本专利技术的具体实施方案，所述的纯化的生物素标记蛋白可置换磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)，冻干保存备用。另一方面，本专利技术还提供了一种包括本专利技术所述的荧光素标记的蛋白四聚体的冻干粉末，其原料组成为本专利技术所述的荧光素标记的蛋白四聚体及冻干溶液，所述冻干溶液为磷酸盐缓冲液(PBS)，含0.5％牛血清白蛋白(BSA)和10％海藻糖(Trehalose)。另一方面，本专利技术还提供了所述的荧光素标记的蛋白四聚体在筛选免疫检测点蛋白的中和性抗体中的应用。细胞株的膜表面表达目标蛋白的配体蛋白，荧光素标记的蛋白四聚体能够与这些配体蛋白结合，进而将细胞标记上荧光素，通过流式检测细胞的荧光强度，加入抗配体蛋白或者抗目标蛋白的中和性抗体，细胞的荧光强度会与加入的中和抗体的浓度梯度成负相关递减趋势。在本专利技术的一类具体的实施方案中，生物素标记的目标蛋白为免疫检测类靶点蛋白，比如PD1,SIRP-alpha，CD80,CD86,CD155等，这类荧光素标记的蛋白四聚体可以用来筛选免疫检测点靶点蛋白的中和性抗体。本专利技术中其方法设计原理参见图3：细胞膜表面表达目标蛋白的配体蛋白，荧光素标记的目标蛋白四聚体能够与之结合，进而将细胞标记上相应的荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光素标记的蛋白四聚体，其是通过荧光素标记的链霉亲和素结合生物素标记的目标蛋白而形成的。/n

【技术特征摘要】
20181229 CN 20181164037631.一种荧光素标记的蛋白四聚体，其是通过荧光素标记的链霉亲和素结合生物素标记的目标蛋白而形成的。


2.根据权利要求1所述的荧光素标记的蛋白四聚体，其中，生物素标记的目标蛋白是由HEK293细胞重组表达的，其N-端或C-端共表达一个AviTag，在BirA酶作用下，AviTag的赖氨酸残基被连接上一个生物素，进而获得生物素标记的目标蛋白。


3.根据权利要求2所述的荧光素标记的蛋白四聚体，其中，生物素标记的目标蛋白是按照以下制备方法获得的：将AviTag基因连接到目标蛋白基因片段的N-端或者C-端，并构建其重组表达载体，然后将该载体质粒与BirA酶质粒共转染到HEK293细胞内，并在细胞培养基内添加生物素(biotin)，收集样品纯化后，获得生物素标记的目标蛋白。


4.根据权利要求3所述的荧光素标记的蛋白四聚体，其中，构建目标蛋白的重组表达载体是将目标蛋白基因和AviTag基因构建到运载体pcDNA3.1上；优选地，BirA酶表达载体构建时所用的运载体也为pcDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：石晓娟，苗景赟，闫爽，刘丛，张晓慧，
申请(专利权)人：北京百普赛斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11