蛋白质的向膜递送制造技术

本发明专利技术提供了一种磷脂组合物，所述的磷脂组合物为包含至少一种嵌入式包含锚定蛋白的蛋白质‑聚合物表面活性剂缀合物的双分子层或微团，所述锚定蛋白为阳离子化蛋白质或阴离子化蛋白质，所述组合物的特征在于所述锚定蛋白为：a)一种活性酶；或b)一种不包含共价键合至氨基酸侧链的‑CH

Membrane delivery of proteins

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质的向膜递送
本专利技术涉及将蛋白质例如活性酶定位在磷脂结构例如细胞膜中的新方法，所述方法还涉及由所述方法产生的结构以及这种结构的用途。
技术介绍
在细胞生物学的许多领域，经常需要在细胞表面用蛋白质或其他物质“标记”细胞。有许多系统可以实现此目的，例如用生物素或链霉亲和素、胶体金颗粒或绿色荧光蛋白(GFP)进行标记。内在膜蛋白也可以是应用在标记过程中的有效靶标。例如，Armstrong等(Nat.Commun.(2015)Jun17；6:7405)描述了一种通过蛋白质的聚合物-表面活性剂的缀合功能使人间充质干细胞(hMSC)功能化的方法，该方法能够将功能蛋白传递至hMSC膜。这是建立在提供了蛋白质-聚合物表面活性剂缀合物(PPSC)的先前工作的基础上，其中表面活性剂分子通过静电相互作用直接(Matsuuraetal.(1993)J.Am.Chem.Soc.vol.155,1261-1264)与蛋白质表面缀合，或通过N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)介导的N,N'-二甲基-1,3-丙二胺(DMPA)基团与溶剂亲和的酸性氨基酸侧链耦合产生的蛋白质表面的阳离子化(Perrimanetal.(2010)NatureChem.vol.2,622-626；Broganetal.(2013)J.Phys.Chem.Bvol.117,8400-8407；Sharmaetal.(2013)Adv.Mater.vol.25,2005-2010)与蛋白质表面缀合。这使工作者能够改变蛋白质在水和有机溶剂中的溶解度(Matsuuraetal.(1993)J.Am.Chem.Soc.vol.155,1261-1264)，或提供液体形式的蛋白质(而非在溶液中；例如参见Perrimanetal.(2010)NatureChem.vol.2,622-626)或形成自支持薄膜形式的蛋白质(harmaetal.(2013)Adv.Mater.vol.25,2005-2010)。本文所述之专利技术提供了用于将特定蛋白质(包括功能性酶)首次定位在磷脂双分子层，例如细胞膜或脂质体膜上的替代方法。
技术实现思路
本专利技术的第一方面提供了一种磷脂组合物，其为包含至少一种嵌入式蛋白质-聚合物表面活性剂缀合物的磷脂双分子层或微团，所述缀合物包含锚定蛋白，所述组合物的特征在于所述锚定蛋白为阳离子化蛋白质或阴离子化蛋白质，并且是(a)一种活性酶；或(b)一种不包含共价键合至氨基酸侧链的-CH2C(O)NCH3(CH2)3N(CH3)2H+接头的蛋白质，例如键合至酸性氨基酸侧链。本文公开的组合物和方法适用于广泛的细胞类型，包括干细胞、淋巴细胞和囊泡(包括外泌体)以及非常广泛的蛋白质。其效果为一个平台，在需要将细胞靶向递送到特定位置的广泛的临床和非临床应用中具有潜力。本专利技术的应用可以解决临床需求未得到满足的几个领域，例如提供用于心脏治疗的干细胞、基于细胞的(cell-based)伤口胶和有机磷酸中毒治疗。技术人员可以容易地判断蛋白质中是否存在共价键合至氨基酸侧链的上述接头(即-CH2C(O)NCH3(CH2)3N(CH3)2H+接头)，例如通过蛋白质组学方法(例如胰蛋白酶消化，然后进行质谱分析)来确定蛋白质的氨基酸组成，从而发现例如上述接头(例如，如本文其他内容所述的DMPA修饰的氨基酸残基)的任何非天然基团。术语“阳离子化蛋白质”或“阴离子化蛋白质”表示锚定蛋白是静电修饰的蛋白质。这是一种与天然状态不同(即不同于野生型蛋白的状态)的蛋白质，因为与天然(或“未修饰”或“野生型”)相比，其表面电荷分布不同。通常，在生理pH下，例如在约pH6-9，例如在约pH6、6.5、7、7.5、8、8.5或约9下评估所述表面电荷分布。所述天然蛋白在本文中可称为“锚定前体蛋白”。如本文所述，在锚定蛋白和锚定前体蛋白之间存在静电修饰差异(例如，在一些实施方案中添加二胺基)，而与蛋白质环境(例如蛋白质溶液)的pH无关。静电修饰可以，如通过锚定前体蛋白的阳离子化，或通过锚定前体蛋白的阴离子化，或通过重组表达比锚定前体蛋白总体具有更大正电荷或更大负电荷的蛋白来实现，例如在如上所述的生理pH下。经修饰总体表面正电荷增加的蛋白质可以被称为阳离子化的蛋白质，而经修饰总体表面负电荷增加的蛋白质可以被称为阴离子化的蛋白质。因此，所述锚定蛋白不是在例如在生理pH测定条件下天然存在的或野生型的蛋白质。对于阳离子化蛋白质，表面正电荷的总体变化可以为+1至+100，例如+1至+80、+10至+70、+20至+60或+30至+50，例如大约+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20、+21、+22、+23、+24、+25、+26、+27、+28、+29、+30、+31、+32、+33、+34、+35、+36、+37、+38、+39、+40、+41、+42、+43、+44、+45、+46、+47、+48、+49、+50、+51、+52、+53、+54或+55。对于阴离子化蛋白质，表面负电荷的总体变化可以为-1至-100，例如-1至-80、-10至-70、-20至-60或-30至-50，例如大约-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30、-31、-32、-33、-34、-35、-36、-37、-38、-39、-40、-41、-42、-43、-44、-45、-46、-47、-48、-49、-50、-51、-52、-53、-54或-55。特定蛋白质的名称可在本文中互换使用，以指代锚定蛋白或锚定蛋白前体。例如，组合物可包含静电修饰的凝血酶，在这种情况下，术语“凝血酶”可用于指锚定蛋白或锚定前体蛋白。或者，阳离子化锚定蛋白在本文中可以用“c”前缀来指代，例如，阳离子化凝血酶为“c凝血酶”。重组制备的超荷电蛋白(如下文进一步描述)在本文中可以以“sc”前缀来指代，例如，超荷OpdA为“scOpdA”。因此，在整个申请文件中使用的锚定前体蛋白是可修饰的或经修饰的可提供锚定蛋白的蛋白。例如，锚定前体蛋白可以进行本文所述的化学静电修饰，或者是可以用作合理设计修饰蛋白的基础或起点的蛋白，与前体蛋白质相比，其总电荷被修饰，修饰的蛋白质使用重组DNA技术表达获得。因此，锚定前体蛋白在生理pH下可以是天然存在的或野生型的蛋白。当锚定蛋白是一种酶时，它是活性酶，即保留了催化由锚定前体蛋白催化的反应的能力的酶。例如，锚定蛋白(为阳离子化或阴离子化锚定前体蛋白)的酶活性可以是锚定前体蛋白酶活性的至少约75％，例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％。酶活性可以由具备常规能力的技术人员，通过与相关酶有关的任何常规方法来确定。在某些情况下，与锚定前体蛋白的活性相比，锚定蛋白(为阳离子化或阴离子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磷脂组合物，所述磷脂组合物为包含至少一种嵌入式包含锚定蛋白的蛋白质-聚合物表面活性剂缀合物的双分子层或微团，所述锚定蛋白为阳离子化蛋白质或阴离子化蛋白质，所述组合物的特征在于所述锚定蛋白为：/na)一种酶；或/nb)一种不包含共价键合至氨基酸侧链的-CH

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170908 GB 1714485.8;20170911 GB 1714566.51.一种磷脂组合物，所述磷脂组合物为包含至少一种嵌入式包含锚定蛋白的蛋白质-聚合物表面活性剂缀合物的双分子层或微团，所述锚定蛋白为阳离子化蛋白质或阴离子化蛋白质，所述组合物的特征在于所述锚定蛋白为：
a)一种酶；或
b)一种不包含共价键合至氨基酸侧链的-CH2C(O)NCH3(CH2)3N(CH3)2H+接头的蛋白质。


2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述蛋白质-聚合物表面活性剂缀合物包含含聚乙二醇的表面活性剂。


3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述蛋白质-聚合物表面活性剂缀合物包含分子量至少约500Da的表面活性剂，任选地，所述表面活性剂为S1783。


4.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述磷脂双分子层形成细胞表面的膜，所述细胞任选地是间充质干细胞或心肌细胞。


5.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述锚定蛋白是不包含共价结合至氨基酸侧链的-CH2C(O)NCH3(CH2)3N(CH3)2H+接头的蛋白质，并且其中所述锚定蛋白连接至第二分子，其为CshA或为包含SEQIDNO：19的CshA功能变体或部分。


6.一种药物组合物，其包含如权利要求1-5任一项所述的磷脂组合物，进一步还包含药学上可接受的载体、稀释剂或媒介物。


7.一种外科组合物，其包含如权利要求1-5任一项所述的磷脂组合物和至少一种外科上可接受的载体、稀释剂或媒介物。


8.一种制备如前述任一项权利要求所述的组合物的方法，其包括
a.提供一种蛋白质-聚合物表面活性剂缀合物；和
b.使磷脂双分子层或微团与所述缀合物接触；
所述蛋白质-聚合物表面活性剂缀合物包含锚定蛋白，所述锚定蛋白是阳离子化蛋白质或阴离子化蛋白质，并且(i)是一种酶和/或(ii)是一种不包含共价键合至氨基酸侧链的-CH2C(O)NCH3(CH2)3N(CH3)2H+接头的蛋白质。


9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述磷脂双分子层为细胞，并且步骤(b)包括使所述细胞与所述缀合物接触，并且在至少约10℃的温度下孵育至少约2分钟的时间，任选地，在上述步骤后进行清洗细胞的步骤。


10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括在使所述表面活性剂与所述蛋白质静电缀合的情况下，使作为阳离子化蛋白质或阴离子化蛋白质的锚定蛋白与所述表面活性剂接触。


11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂包含聚乙二醇。


12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂具有至少约500Da的分子量，任选地其中所述表面活性剂包含S1783。


13.如权利要求10、11或12所述的方法，其特征在于，所述锚定蛋白通过以下方法获得：
i.将锚定前体蛋白溶液与N,N’-二甲基-1,3-丙二胺(DMPA)或其类似物的pH中和溶液混合，并任选地将得到的混合物的pH调至5-7；
ii.随后或同时加入碳二亚胺，例如N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，并将得到的混合物的pH调至4-7；
iii.将(ii)所得混合物于0-25℃、pH4-7搅拌1-30小时；
iv.在水或缓冲液中，于pH6.5-8.5透析(iii)所得混合物中的蛋白质至少4小时；
v.如果需要，将(iv)所得混合物的pH调节至pH6.5-8.5；
其中，所述锚定前体蛋白是一种酶；进一步地：
-步骤(iii)持续不超过约120分钟；和/或
-所述方法进一步包括步骤(vi)：对步骤(iv)或步骤(v)(如果存在)所得混合物进行尺寸排阻层析。


14.如权利要求10、11或12所述的方法，其特征在于，所述锚定蛋白通过包括表达编码超荷电蛋白的重组DNA序列的方法获得。


15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述重组DNA序列编码包含所述超荷电蛋白和第二分子的融合蛋白。


16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第二分子包含下述的一种或多种：CshA、包含SEQIDNO：19的CshA功能变体或部分、OpdA(SEQIDNO：10或SEQIDNO：39)、凝血酶、凝血酶原、PlGF-2(SEQIDNO：22)、包含SEQIDNO：21的PlGF-2功能变体或部分、SpyCatcher多肽(SEQIDNO：23)或SpyTag多肽(SEQIDNO：24)，或包含上述任一物质的功能变体，所述功能变体与非变体序列具有至少约60％的序列同一性的。


17.如权利要求14-16中任一项的方法，其特征在于，所述重组DNA序列具有序列SEQIDNO：4-7。


18.一种用蛋白质标签标记细胞的方法，其包括如权利要求8-17中任一项所述的方法，其中所述磷脂双分子层构成细胞的外膜，并且所述蛋白质-聚合物表面活性剂缀合物包含所述蛋白质标签。


19.如权利要求18的方法，其特征在于，权利要求8所述的方法的步骤(a)包括在使所述表面活性剂与所述蛋白质静电缀合的情况下，使作为阳离子化蛋白质或阴离子化蛋白质的锚定蛋白与表面活性剂接触；进一步地，其中所述锚定蛋白通过包括表达编码融合蛋白的重组DNA序列的方法获得，所述融合蛋白包含超荷电蛋白和第二分子，其中所述蛋白质标签是第二分子。


20.一种组织工程支架，其包含如权利要求1-5中任一项所述的磷脂组合物。


21.如权利要求20所述的组织工程支架，其特征在于，所述磷脂组合物包含锚定蛋白，已知所述锚定蛋白的锚定前体蛋白形式促进组织的生长和/或修复，和/或其中所述磷脂组合物包含已知促进组织生长和/或修复的第二分子。


22.如权利要求21所述的组织工程支架，其特征在于，所述锚定蛋白是阳离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚当·威廉斯·佩里曼，罗伯特·克里斯托弗·德勒，肖文晋，托马斯·莱恩·菲利普·格林，本杰明·迈克尔·卡特，格雷厄姆·约翰·戴，罗萨莉娅·库阿特孔奇·德林特，
申请(专利权)人：布里斯托大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB