帕妥珠单抗耐药性突变的应用、检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种帕妥珠单抗耐药性突变的应用、检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术基于生物信息学分析，并通过分子模拟分析、流式亲和力实验以及体外抗肿瘤活性实验证实，S310F是帕妥珠单抗的耐药性突变，HER2蛋白S310F突变或编码带有S310F突变蛋白的HER2基因作为分子标记在制备检测帕妥珠单抗耐药性的试剂盒中的应用。一种用于检测帕妥珠单抗耐药性的试剂盒，包括：用于检测HER2蛋白S310F突变的抗体，或用于检测编码带有S310F突变蛋白的HER2基因的引物对。本发明专利技术基于ARMS‑PCR技术原理，建立了耐药突变HER2S310F的检测方法。该检测方法可作为帕妥珠单抗治疗的伴随诊断方案，操作简便、成本低，对临床避免帕妥珠单抗的不合理应用、减轻患者负担具有重大意义。

Application, test kit and test method of drug resistance mutation of patozumab

【技术实现步骤摘要】
帕妥珠单抗耐药性突变的应用、检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及帕妥珠单抗耐药性突变的应用、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
HER2蛋白属于表皮生长因子受体家族，是一个具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，由胞外区结合域、亲脂跨膜域以及胞内酪氨酸激酶域构成，其中胞外区又可分为4个亚结构域(I、Ⅱ、Ⅲ、IV)。HER2通过激活不同信号通路参与调控正常细胞的增殖、分化和存活，然而其异常表达与多种实体瘤的发生、发展密切相关，因此其被认为是肿瘤靶向治疗重要的靶点。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗是FDA批准用于治疗HER2阳性肿瘤的单克隆抗体药物，它们在临床上的应用显著提高了HER2阳性肿瘤患者的生存率。但是，耐药性问题普遍存在于肿瘤诊疗过程中，且极大地限制了抗体靶向药物的治疗效果。目前，已被熟知的耐药机制有EGFR和HER3等受体的异常表达、PTEN基因缺失和PIK3CA基因突变等。随着靶向HER2抗体越来越广泛的应用，其他潜在的耐药机制也逐渐被发现和阐明，其中HER2基因突变已成为重要的耐药机制之一。液体活检是精准医疗领域中一项重大的技术革新，对个体化医疗的发展具有重要的推动作用，目前正受到广泛关注。液体活检具有无创、取样简便的优势，能够实现动态监测患者外周血中的肿瘤分子标志物，为患者治疗提供实时动态监测的数据和依据。细胞游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)是循环血中游离于细胞外的机体内源性DNA，主要来源于细胞的凋亡和坏死。肿瘤患者外周血cfDNA中则可能携带有肿瘤基因组信息如基因突变，因此通过检测cfDNA可为肿瘤患者提供及时、可靠的治疗依据。目前，用于液体活检的检测方法主要包括高通量测序、数字PCR和ARMS-PCR。高通量测序检测周期长、灵敏度低；数字PCR对实验操作要求严格、开发成本昂贵；而ARMS-PCR作为临床常用的突变检测方法，操作简便、灵敏度较高。
技术实现思路
本专利技术针对抗体靶向药物耐药性问题，提供一种帕妥珠单抗耐药性突变的应用、检测试剂盒及检测方法。本专利技术首先提供了HER2蛋白S310F突变或编码带有S310F突变蛋白的HER2基因作为分子标记在制备检测帕妥珠单抗耐药性的试剂盒中的应用。S310F表示HER2蛋白的310位丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)。检测时可以通过检测蛋白水平的突变情况，也可以检测基因水平的突变情况。本专利技术研究发现，带有S310F突变的情况下，对帕妥珠单抗存在耐药。本专利技术又提供了一种用于检测帕妥珠单抗耐药性的试剂盒，包括：用于检测HER2蛋白S310F突变的抗体，或用于检测编码带有S310F突变蛋白的HER2基因的引物对。所述引物对包括上游引物和下游引物，序列为：上游引物：5’-CCTTTCTACGGACGTGGGACT-3’，下游引物：5’-CTCGGGCACAGGGCTTG-3’。所述的试剂盒，还包括荧光染料SYBR、ROX及阳性对照质粒。所述阳性对照质粒包括：带有野生型HER2基因的质粒，以及带有S310F突变型HER2基因的质粒。本专利技术还提供了一种非疾病诊断为目的的、检测帕妥珠单抗耐药性的方法，包括以下步骤：使用引物对通过荧光定量PCR反应扩增带有S310F突变的HER2基因序列，所述引物对包括上游引物和下游引物，序列为：上游引物：5’-CCTTTCTACGGACGTGGGACT-3’，下游引物：5’-CTCGGGCACAGGGCTTG-3’。该检测帕妥珠单抗耐药性的方法除了能够用于指导临床用药之外，还能够用于科学研究，或者用于研发针对带有S310F突变的HER2蛋白的非耐药性的药物。所述的方法中荧光定量PCR反应体系为：所述的方法中荧光定量PCR反应程序为：两步法：95℃预变性30s；95℃变性5s，64℃退火延伸20s，40循环；熔解曲线95℃15s；60℃1min；95℃15s。本专利技术基于生物信息学分析，发现位于HER2蛋白胞外区II亚结构域中的高频突变HER2S310F。通过分子模拟分析、流式亲和力实验以及体外抗肿瘤活性实验证实，S310F是帕妥珠单抗的耐药性突变，突显出单个体细胞突变在肿瘤靶向药物耐药中的重要性。此外，本专利技术基于ARMS-PCR技术原理，通过设计特异性突变检测引物，即在引物3’末端的倒数第二位引入了一个错配碱基，使得突变型模板能够特异性扩增，从而建立了耐药突变HER2S310F的检测方法。该检测方法可作为帕妥珠单抗治疗的伴随诊断方案，操作简便、成本低，对临床避免帕妥珠单抗的不合理应用、减轻患者负担具有重大意义。附图说明图1为HER2胞外区突变在不同癌症类型中的分布情况结果图，其中A为膀胱癌，B为胃癌，C为乳腺癌。图2为分子模拟分析结果图，其中A为帕妥珠单抗与野生型HER2的相互作用，B为帕妥珠单抗与S310F突变型HER2的相互作用。图3为流式亲和力检测结果图。图4为帕妥珠单抗对肿瘤细胞活性抑制试验结果图，其中A为MCF7细胞(阴性对照)，B为MCF7-HER2WT细胞，C为MCF7-HER2S310F细胞。图5为检测HER2S310F突变的标准曲线图。图6为检测HER2S310F突变的扩增曲线图。具体实施方式实施例11.1癌症体细胞突变分析从TCGA数据库(https://gdc.cancer.gov/,MC3)和COSMIC数据库(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic,V89)中下载来源于33种癌症类型的体细胞突变信息。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)鉴定出HER2胞外区氨基酸性质改变的错义突变，同时通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)进行手动筛选。随后，用R软件(https://www.r-project.org/)对筛选得到的突变进行统计分析。结果如图1所示，HER2S310F是所有癌症类型中发生频率最高的HER2胞外区突变。其中在膀胱癌中发生率约为5％(21/412)，胃癌中发生率约为1.3％(6/440)，乳腺癌中发生率约为0.1％(1/986)。1.2分子模拟分析S310F突变位于HER2胞外区Ⅱ亚结构域中，且是帕妥珠单抗与HER2受体的结合表位之一。后续通过分子模拟分析来预测S310F突变对帕妥珠单抗与HER2受体结合的影响。以HER2-帕妥珠单抗复合物(PDBID:1S78)的X射线晶体结构为模板，利用PyMOL软件将HER2胞外区第310位的丝氨酸突变为苯丙氨酸。结果如图2所示，与野生型HER2相比，S310F突变型HER2引入了一个非极性侧链，这可能会干扰帕妥株单抗与HER2受体的相互作用。1.3流式亲和力验证采用流式分析术测试帕妥珠单抗与野生型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.HER2蛋白S310F突变或编码带有S310F突变蛋白的HER2基因作为分子标记在制备检测帕妥珠单抗耐药性的试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.HER2蛋白S310F突变或编码带有S310F突变蛋白的HER2基因作为分子标记在制备检测帕妥珠单抗耐药性的试剂盒中的应用。


2.一种用于检测帕妥珠单抗耐药性的试剂盒，其特征在于，包括：用于检测HER2蛋白S310F突变的抗体，或用于检测编码带有S310F突变蛋白的HER2基因的引物对。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，序列为：
上游引物：5’-CCTTTCTACGGACGTGGGACT-3’，
下游引物：5’-CTCGGGCACAGGGCTTG-3’。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光染料SYBR、ROX及阳性对照质粒。


5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照质粒包括：带有野生型HER2基因的质粒，以及...

【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，杨晓月，周展，陈枢青，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33