一种转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法。包括以下步骤：(1)采用基因克隆的方法从红花中克隆获得CTMYB1基因；(2)载体的构建和转化；(3)红花毛状根的诱导；(4)将转基因毛状根的鉴定；(5)GUS染色鉴定转化效率；(6)三氯化铝法测定总黄酮含量。本发明专利技术具有提高红花毛状根中黄酮类有效成分含量,进而在短时间内可以获得大量的红花黄酮，为我国商业化生产利用红花黄酮提供新型优质药源的特点的有益效果。

A method of transforming ctmyb1 gene to improve the content of flavonoids in hairy roots of safflower

【技术实现步骤摘要】
一种转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法
本专利技术涉及一种提高红花毛状根黄酮含量的方法，特别是一种转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法。
技术介绍
红花(拉丁学名：CarthamustinctoriusL.)：双子叶植物纲，合瓣花亚纲，桔梗目，菊科，管状花亚科，菜蓟族，红花属，红花种。别名：红蓝花、刺红花，干燥的管状花，橙红色，花管狭细，先端5裂，裂片狭线形，花药黄色，联合成管，高出裂片之外，其中央有柱头露出。具特异香气，味微苦。以花片长、色鲜红、质柔软者为佳。主产河南、湖南、四川、新疆、西藏等地。活血通经，散瘀止痛，有助于治经闭、痛经、恶露不行、胸痹心痛、瘀滞腹痛、胸胁刺痛、跌打损伤、疮疡肿痛疗效。有活血化瘀，散湿去肿的功效。红花油是世界公认的具有食用、保健、美容之功效的食用油。作为一种药用和工业用价值极高的作物,红花具有巨大的开发潜力。近年来,红花因产量低、产品开发跟不上等原因,在我国的种植面积不大,是一种典型的“未被充分利用作物”。目前尚未发现通过CTMYB1基因过表达以大量获得红花黄酮类有效成分含量的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，是为了解决现在红花黄酮的产量低的问题，提供一种转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法。本专利技术具有提高红花毛状根中黄酮类有效成分含量,进而在短时间内可以获得大量的红花黄酮，为我国商业化生产利用红花黄酮提供新型优质药源的特点。本专利技术的技术方案：一种转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法，包括以下步骤：(1)采用基因克隆的方法从红花中克隆获得CTMYB1基因；(2)载体的构建和转化；(3)红花毛状根的诱导；(4)将转基因毛状根的鉴定；(5)GUS染色鉴定转化效率；(6)三氯化铝法测定总黄酮含量。前述的转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法中，所述步骤(1)中，是利用TRIzol法提取红花叶片总RNA,进行反转录操作,以cDNA作为PCR模板；反转录反应体系为20μL,含2μLRNase-freeWater、10μL2×TSReactionMix、4μL总RNA、1μLgDNARemover、1μL0.5g/μL的AnchoredOligo(dT)Primer、1μL0.1g/μL的RandomPrimer和1μLMixransScriptRT/RIEnzymeMix；反转录程序为25℃5min,42℃1h,75℃灭活5min,室温冷却5min,反应完成后离心,作为PCR反应的模板；上游引物序列为5′-ATGGGAAGAGCTCCTTGTTGT-3′,下游引物序列为5′-TCACAAGTTCTCATCTCCATCCTG-3′；PCR反应总体系20μL,含1μL反转录产物、1μL10mmol/L的上下游引物各、10μLREMiX和ddH2O补至20μL。前述的转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法中，所述PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1min,31个循环，最后72℃延伸10min，PCR结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测；将PCR产物用TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer4.0进行切胶回收纯化后,连接到pMD19-TVector(TaKaRa)上,热激转化到大肠杆菌DH5α,进行氨苄(Ampicillin)抗性筛选；挑取单克隆菌株进行液体培养,用M13引物进行菌液PCR检测，选取含阳性质粒的菌液用M13引物进行双向测序,将测序结果进行拼接,得到CTMYB1基因。前述的转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法中，所述步骤(2)中，根据同源重组的方法在上下游引物前加入8bp载体同源序列和酶切位点,上游引物CTMYB1-F“5′-CCATGGAGATGGGAAGAGCTCCTTGTTGT′”和下游引物CTMYB1-R“5′-GGTGACCTCACAAGTTCTCATCTCCATCCTG-3′”,酶切位点为NcoI和Eco91I；以T载体作为模板进行PCR扩增,PCR方法和体系与步骤(1)相同,切胶回收纯化与步骤(1)相同；对pCAMBIA3301进行NcoI和Eco91I双酶切；酶切体系为10μL,含质粒DNA6μL、NcoI和Eco91I各1μL、10×bufferFly1μL、ddH2O补至10μL,37℃放置2h；CTMYB1片段与纯化pCAMBIA3301连接，采用同源重组方式进行载体连接,体系10μL,含PCR纯化产物1μL、5×Ligation-FreeCloningMasterMix4μL、pCAMBIA33012μL、用ddH2O补至10μL：反应条件为冰浴30min；热激转化到大肠杆菌的方法和测序与步骤(1)相同；农杆菌制备以及转化,pCAMBIA3301空载体转入农杆菌A4，通过PCR鉴定转GUS基因和CTMYB1基因的发根农杆菌A4；反应程序为95℃预变性5min；94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1min,31个循环,最后72℃延伸10min，PCR结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测。前述的转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法中，所述步骤(3)中，用取两瓶15-30天龄的的红花无菌苗；一组加入到50毫升侵染液A“50mlOD值-600-0.6农杆菌A4”，使下胚轴和子叶均完全浸泡在液体中，侵染10分钟。一组加入到50毫升侵染液B“50mlOD值-600-0.6农杆菌A4带有GUS报告基因”中；另外一组加入到50毫升侵染液C“50mlOD值-600-0.6农杆菌A4带有CTMYB1基因”中；加入MS培养基中25℃，暗培养大约24-72h，暗培养结束以后，转移含有200mg/ml头孢的MS固体培养基15天以后下胚轴和子叶分化形成毛状根，剪去2-4CM毛状根在加入100mg/ml头孢MS固体培养基上进行筛选培养，15天以后筛选出生长速度快的红花毛状根在含50mg/ml头孢的MS固体培养基上进行继代培养，继代培养2次以后，得到脱毒的红花毛状根，然后剪去2-4CM毛状根在加入MS液体培养基上进行扩大培养，最后在MS培养基上继续筛选,得野生型、GUS报告基因、转基因的无菌毛状根。前述的转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法中，所述步骤(4)中，采用CTAB法提取毛状根总DNA,GUS引物设计为5'-AACGGGGAAACTCAGCAAGC-3'和5'-CAAATCGCCGCTTTGGACATA-3',目的基因285bp；CTMYB1引物设计为上游引物序列为5′-ATGGGAAGAGCTCCTTGTTGT-3′,下游引物序列为5′-TCACAAGTTCTCATCTCCATCCTG-3′，目的基因750bp；通过PCR对转入GUS基因和CTMYB1基因的毛状根进行鉴定,反应程序为95℃预变性5min；94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1min,31个循环；最后72℃延伸10min；PCR反应结束本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)采用基因克隆的方法从红花中克隆获得CTMYB1基因；/n(2)载体的构建和转化；/n(3)红花毛状根的诱导；/n(4)将转基因毛状根的鉴定；/n(5)GUS染色鉴定转化效率；/n(6)三氯化铝法测定总黄酮含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)采用基因克隆的方法从红花中克隆获得CTMYB1基因；
(2)载体的构建和转化；
(3)红花毛状根的诱导；
(4)将转基因毛状根的鉴定；
(5)GUS染色鉴定转化效率；
(6)三氯化铝法测定总黄酮含量。


2.根据权利要求1所述的转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，是利用TRIzol法提取红花叶片总RNA,进行反转录操作,以cDNA作为PCR模板；反转录反应体系为20μL,含2μLRNase-freeWater、10μL2×TSReactionMix、4μL总RNA、1μLgDNARemover、1μL0.5g/μL的AnchoredOligo(dT)Primer、1μL0.1g/μL的RandomPrimer和1μLMixransScriptRT/RIEnzymeMix；反转录程序为25℃5min,42℃1h,75℃灭活5min,室温冷却5min,反应完成后离心,作为PCR反应的模板；上游引物序列为5′-ATGGGAAGAGCTCCTTGTTGT-3′,下游引物序列为5′-TCACAAGTTCTCATCTCCATCCTG-3′；PCR反应总体系20μL,含1μL反转录产物、1μL10mmol/L的上下游引物各、10μLREMiX和ddH2O补至20μL。


3.根据权利要求2所述的转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法，其特征在于：所述PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1min,31个循环，最后72℃延伸10min，PCR结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测；
将PCR产物用TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer4.0进行切胶回收纯化后,连接到pMD19-TVector(TaKaRa)上,热激转化到大肠杆菌DH5α,进行氨苄(Ampicillin)抗性筛选；挑取单克隆菌株进行液体培养,用M13引物进行菌液PCR检测，选取含阳性质粒的菌液用M13引物进行双向测序,将测序结果进行拼接,得到CTMYB1基因。


4.根据权利要求1所述的转CTMYB1基因提高红花毛状根黄酮含量的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，根据同源重组的方法在上下游引物前加入8bp载体同源序列和酶切位点,上游引物CTMYB1-F“5′-CCATGGAGATGGGAAGAGCTCCTTGTTGT′”和下游引物CTMYB1-R“5′-GGTGACCTCACAAGTTCTCATCTCCATCCTG-3′”,酶切位点为NcoI和Eco91I；以T载体作为模板进行PCR扩增,PCR方法和体系与步骤(1)相同,切胶回收纯化与步骤(1)相同；对pCAMBIA3301进行NcoI和Eco91I双酶切；酶切体系为10μL,含质粒DNA6μL、NcoI和Eco91I各1μL、10×bufferFly1μL、ddH2O补至10μL,37℃放置2h；CTMYB1片段与纯化pCAMBIA3301连接，采用同源重组方式进行载体连接,体系10μL,含PCR纯化产物1μL、5×Ligation-FreeCloningMasterMix4μL、pCAMBIA33012μL、用ddH2O补至10μL：反应条件为冰浴30min；热激转化到大肠杆菌的方法和测序与步骤(1)相同；农杆菌制备以及转化,pCAMBIA3301空载体转入农杆菌A4，通过PCR鉴定转GUS基...

【专利技术属性】
技术研发人员：程剑平，范昱，赖弟利，陈星宇，薛国兴，何艾玲，周月霞，欧阳子泽，李隆，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52