萝卜耐盐基因RsNHX1及应用制造技术

本发明专利技术属于植物生物技术与分子育种领域，涉及萝卜盐胁迫响应过程中显著变化基因

Rsnhx1 and its application in Radish

【技术实现步骤摘要】
萝卜耐盐基因RsNHX1及应用
本专利技术属于植物生物技术与分子育种领域，涉及萝卜盐胁迫响应过程中显著变化基因RsNHX1，具体涉及萝卜耐盐基因RsNHX1及应用。
技术介绍
萝卜(RaphanussativusL.，2n＝2x＝18)，又名莱菔，为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，是原产于我国的重要根菜类蔬菜作物。萝卜以膨大肉质直根为主要产品器官，营养丰富，用途多样，食疗价值极高，深受人们喜爱，在我国蔬菜生产和周年供应中占有重要地位。近年来，蔬菜基地土壤发生盐渍化隐患，迫使蔬菜作物受到不同程度的盐害影响，表现为出苗缓慢、根系生长受抑制、植株矮小、叶片卷曲枯黄，茎叶枯死、生长停滞等现象，严重影响了蔬菜的产量和品质。分离鉴定植物耐盐性状的关键功能基因，运用分子标记辅助育种、转基因等生物技术手段有利于加速耐盐蔬菜作物种质创新，大力缩短耐盐品种选育进程。Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+exchangerorantiporter)，简称NHX、NHE或NHA，是一种跨膜蛋白，可将细胞质中过多Na+在液泡内区隔化和将Na+排出细胞外，以维持细胞质Na+稳态。前人通过模式植物拟南芥、水稻中的研究表明NHX基因家族的相关成员可能在植物抵御逆境胁迫方面发挥着重要作用，如细胞扩张、pH和离子平衡调控、渗透调节、膜泡运输、蛋白加工和花器官发育等，然而萝卜中的NHX基因的分离鉴定与生物学功能分析尚未报道。病毒诱导的基因沉默(Virusinducedgenesilencing，VIGS)技术是一种由病毒介导的通过转录后引起基因沉默，可以从植物表型或生理指标上的变化来反向验证基因的生物学功能。目前VIGS技术已在烟草、番茄、白菜等植物中得到应用，具有操作简单、周期短、沉默效率高，可在不同遗传背景下生效等优点，可适用于基因功能的鉴定。但前期研究主要通过真空浸透浸染及活体注射方法，容易出现浸染效率低、病毒随机侵染植株其它部位等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于填补萝卜耐盐基因RsNHX1的空白，提供萝卜耐盐基因RsNHX1的cDNA序列，采用RT-qPCR技术分析盐胁迫下不同时间RsNHX1基因的表达特性，进一步设计克隆引物构建pCAMBIA2301-RsNHX1过表达载体，转化拟南芥后kan+筛选，以及盐处理表型鉴定。进一步地，本专利技术还运用芜菁黄化花叶病毒(TYMV)衍生的病毒诱导基因沉默的载体pTY-s，构建pTY-RsNHX1抑制表达载体，首次在萝卜中建立病毒诱导内源基因沉默进而验证萝卜耐盐基因生物学功能的体系。为了实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：本专利技术提供了一种萝卜耐盐基因RsNHX1，所述萝卜耐盐基因RsNHX1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。作为优选，所述萝卜耐盐基因RsNHX1完整的ORF包含1635bp，所述萝卜耐盐基因RsNHX1的理论分子量以及等电点分别是60233.35和7.16。作为优选，克隆所述萝卜耐盐基因RsNHX1的上游引物RsNHX1-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；克隆所述萝卜耐盐基因RsNHX1的下游引物RsNHX1-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了含有所述的耐盐基因RsNHX1的转运蛋白。其中，所述转运蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种萝卜耐盐基因RsNHX1的获取方法，所述获取方法包括以下步骤：1)选择‘NAU-XBC’品种提取RNA；2)反转录获得‘NAU-XBC’的cDNA；3)以‘NAU-XBC’的cDNA为模板，用特异引物RsNHX1-F以及RsNHX1-R进行PCR扩增纯化；所述特异引物RsNHX1-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述特异引物RsNHX1-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；4)将纯化后的产物T-A克隆，检测PCR产物，选择对应片段的重组子进行DNA测序，得到萝卜耐盐基因RsNHX1。本专利技术还提供了所述的萝卜耐盐基因RsNHX1、所述的转运蛋白的过表达载体、抑制表达载体、细胞或重组菌。其中，作为优选，所述过表达载体为pCAMBIA2301-RsNHX1。本专利技术还提供了一种萝卜耐盐基因RsNHX1的抑制表达载体，所述抑制表达载体为pTY-RsNHX1。本专利技术还提供了所述的萝卜耐盐基因RsNHX1、所述的转运蛋白、所述的过表达载体、抑制表达载体、细胞或重组菌在培育抗盐拟南芥或耐盐性萝卜中的应用。其中，作为优选，所述培育耐盐性萝卜的条件为：在水培加盐胁迫的条件下进行处理，所述盐浓度为250mMNaCl。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术萝卜耐盐基因RsNHX1在250mMNaCl胁迫处理不同时间(0h、3h、6h、12h、24h、48h和96h)后，具有明显的上调表达，在盐处理24h后达到最高的相对表达水平，并在一段时间后表达量基本回到处理前的表达水平。还构建了过表达载体遗传转化拟南芥和瞬时表达载体沉默萝卜耐盐基因RsNHX1，从而验证萝卜耐盐基因RsNHX1的功能。本专利技术通过转录组和蛋白组等组学联合分析，并结合RT-qPCR技术发现萝卜NHX家族成员RsNHX1基因在盐胁迫响应过程中具有显著变化，同时本专利技术采用基因枪轰击法克服了真空浸透浸染及活体注射存在的不足，首次实现了在萝卜特定部位叶片快速反向鉴定耐盐基因的生物学功能。研究结果将为实现利用基因工程技术手段提高萝卜耐盐性及种质遗传改良与种质创新提供重要理论基础。本专利技术采用上述技术方案提供了一种萝卜耐盐基因RsNHX1发掘与功能验证体系，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。附图说明图1为RsNHX1的cDNA测序与基因组数据库比对。图2为RsNHX1基因在250mMNaCl处理不同时间的组织特异性表达。图3为RsNHX1基因克隆的电泳图。图4为双酶切重组质粒和表达载体pCAMBIA2301的电泳图；其中，泳道1、2表示用相应的限制性内切酶BamHI和KpnI对pMD18-RsNHX1进行双酶切，泳道3表示用相应的限制性内切酶BamHI和KpnI对本实验室保存的pCAMBIA2301载体进行双酶切。图5为RsNHX1过表达载体双酶切验证的电泳图。图6为农杆菌菌液检测电泳图；其中，左图为：特异引物菌液检测结果；右图为：M13通用引物检测结果；泳道1～5分别代表不同的单克隆，农杆菌转化平板上任意挑取的5个单克隆。图7为T1代RsNHX1过表达转基因拟南芥PCR检测，泳道1表示野生型拟南芥PCR检测结果，泳道2～6表示T1代RsNHX1过表达转基因拟南芥PCR检测结果。图8为过表达RsNHX1拟南芥的筛选；WT为野生型，OENHX1为过表达RsNHX1。图9为过表达RsNHX1拟南芥GUS(β-glucuronidase)染色图；WT为野生型，OENHX1为过表达RsNHX1。图10为过表达RsNHX1拟南芥表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种萝卜耐盐基因RsNHX1，其特征在于，所述萝卜耐盐基因RsNHX1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种萝卜耐盐基因RsNHX1，其特征在于，所述萝卜耐盐基因RsNHX1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.含有权利要求1所述的耐盐基因RsNHX1的转运蛋白。


3.根据权利要求2所述的转运蛋白，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.一种萝卜耐盐基因RsNHX1的获取方法，其特征在于：所述获取方法包括以下步骤：
1)选择‘NAU-XBC’品种提取RNA；
2)反转录获得‘NAU-XBC’的cDNA；
3)以‘NAU-XBC’的cDNA为模板，用特异引物RsNHX1-F以及RsNHX1-R进行PCR扩增纯化；所述特异引物RsNHX1-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述特异引物RsNHX1-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
4)将纯化后的产物T-A克隆，检测PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕，应佳丽，柳李旺，张旸，徐良，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32