一种矮牵牛花药发育相关PhDof4基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种矮牵牛花药发育相关PhDof4基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术公开的矮牵牛Dof基因家族成员PhDof4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。构建PhDof4基因的RNAi表达载体转化矮牵牛，能使转基因植株矮化、花期提前、花药发育不正常，表明PhDof4是调控矮牵牛花药生长发育重要基因。本发明专利技术还公开了该基因的花药育性调控的基因工程改良方法，该方法能为进一步研究矮牵牛花药发育的分子机制提供参考，对雄性不育基因工程、矮牵牛杂交育种、杂种优势利用、品种生产都具有实际应用价值。

A phardof4 gene related to anther development of Petunia and its application

【技术实现步骤摘要】
一种矮牵牛花药发育相关PhDof4基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，更具体地说，涉及一种矮牵牛花药发育相关PhDof4基因及其应用。
技术介绍
Dof基因家族蛋白是植物特有的一类转录调控因子，除了与本家族蛋白互作，还与其它家族蛋白成员互作，其在植物组织分化、种子发育、逆境胁迫、植物生理代谢等方面具有重要的调控作用。自1993年从玉米中鉴定报道了第一个ZmDof1(MNB1a)转录因子以来，已在多种单子叶植物和双子叶植物中发现了Dof基因。其中拟南芥基因组中存在37个Dof基因(Yanagisawa，2002)，水稻基因组中存在30个(Lijavetzkyetal，2003)，大麦中有26个(Moreno-Risuenoetal，2007b)，大豆中有28个(Wangetal，2007)，南瓜(Kisuetal，1998)、烟草(Baumannetal，1999)、小麦(Chenetal，2005)和马铃薯(Pleschetal，2001)等植物中也都存在Dof基因。Dof蛋白一般由200～400个氨基酸组成，具有特异和高度保守的DNA结合域，即位于N末端由52个氨基酸组成的Dof域。Dof蛋白以其Dof结构域与不同的植物特异性基因的启动子相互作用，在每一个Dof蛋白的DNA结合序列中均存在有AAAG序列。AAAG序列和其反向互补序列CTTT是Dof蛋白识别的核心序列。除了Dof结构域外，Dof蛋白包含的另一个主要的结构域是位于C末端的调控结构域。与保守的Dof结构域不同，转录调控结构域的氨基酸序列较为多变，不具保守性，它很可能通过与不同类型调控蛋白或物质的反应，受不同途径信号的调控而激活或抑制基因的转录。这种多样性可能是Dof功能多样性的基础之一。矮牵牛(Petuniahybrida)属茄科(Solanaceae)碧冬茄属(Petunia)，是世界上最重要的园艺观赏植物之一，因生长周期短，遗传背景清晰，生长周期短，可进行种子、扦插、嫁接等繁殖，一直以来作为研究花卉基因功能与花发育分子机制的模式植物。从矮牵牛中分离并克隆相关的Dof基因并揭示其功能，有利于研究Dof基因家族在植物生长发育中的分子调控机理，以进一步应用于植物的性状改良。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种矮牵牛花药发育相关基因PhDof4。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供前述矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种矮牵牛花药发育相关基因PhDof4，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。含有所述的矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的载体、重组菌或细胞。优选地，所述的矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的载体，为pEASY-Blunt-PhDof4或PhDof4-RNAi。所述的矮牵牛花药发育相关基因PhDof4在调控植物花药育性或植物形态中的应用。优选地，所述的花药发育相关基因PhDof4在调控植物花药育性中的应用，包括如下步骤：1)构建含有矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的载体；2)将所构建的矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的载体转化到植物或植物细胞中；3)培育筛选得到花药败育的转基因植物株系。优选地，所述的花药发育相关基因PhDof4在调控植物形态中的应用，包括如下步骤：1)构建含有矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的载体；2)将所构建的矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的载体转化到植物或植物细胞中；3)培育筛选得到叶色变浓绿、植株变矮小或节间缩短的转基因植物株系。优选地，所述的含有矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的载体是PhDof4-RNAi。优选地，所述的植物为矮牵牛。有益效果：相比于现有技术，本专利技术的优点为：(1)本专利技术公开了一种矮牵牛PhDof基因家族成员PhDof4基因。其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；(2)本专利技术基于前期的研究和生物信息学分析软件初步预测了基因功能，通过基因克隆得到基因序列全长，通过Real-TimePCR确定其表达模式，通过亚细胞定位、构载体及转基因等技术鉴定和分析了其基因功能，发现转基因植株相对于CK，叶色浓绿、花期提前、植株更加矮小、节间缩短，在花药发育方面出现花药变小、畸形、败育等现象，对转基因植株进行了套袋收种，植株的结实率大大降低，子房变小，每果种子量大大减少。上述结果表明，PhDof4在花药发育方面发挥了重要调控作用；(3)本专利技术矮牵牛PhDof4基因可为进一步研究矮牵牛花药发育的分子机制提供参考，为利用基因工程调控植物雄性生殖器官——花药的发育提供有效的分子工具。能够有助于构建矮牵牛雄性不育系，从而促进杂种优势利用，对矮牵牛品种改良以及新品种培育具有实际应用价值。附图说明图1为PhDof4基因在烟草叶片中的亚细胞定位图；上半部图为携带35s：：GFP：空载体pCAMBlAl300的农杆菌GV3101在烟草下表皮细胞的表达情况图；下半部图为携带35s：：GFP-目的基因PhDof4的农杆菌GV3101在烟草下表皮细胞的表达情况图；图2为PhDof4-RNAi载体转化矮牵牛植株PCR阳性检测结果图；CK1：阳性对照；CK2：阴性对照；图3为PhDof4-RNAi载体转化矮牵牛表型图；图4为PhDof4-RNAi载体转化矮牵牛花药的扫描电镜图，CK：野生型；图5为PhDof4-RNAi载体转化矮牵牛花药的半薄切片图，CK：野生型；图6为PhDof4-RNAi载体转化矮牵牛不同组织部位的PhDof4表达分析图，图中，Bud：花芽，Stem：茎，CK：野生型；图7为PhDof4-RNAi载体转化矮牵牛的叶绿素含量测定结果图，CK：野生型。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法，均可参照分子生物学常规实验方法进行，或者按照试剂盒或说明书进行。实施例1：矮牵牛PhDof4基因的cDNA克隆与鉴定植物材料：矮牵牛(Petuniahybrida)幻想“W115”品种由南京林业大学风景园林重点实验室提供，播种于南京林业大学风景园林学院生长室，自然条件下播种生长。基因来源：基于前期课题组已有的矮牵牛花药转录组数据库(未发表)挑选而出并命名，再结合PrimerPremier5.0设计全长特异性引物。PhDof4-F：5′-AGGAGACGAGGATGATGATAAGG-3′；PhDof4-R：5′-CACTGCCATCCTGTCTGATACTT-3′。从矮牵牛总RNA中扩增PhDof4基因，具体包括如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种矮牵牛花药发育相关基因PhDof4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种矮牵牛花药发育相关基因PhDof4，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.含有权利要求1所述的矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的载体、重组菌或细胞。


4.根据权利要求3所述的矮牵牛花药发育相关基因PhDof4的载体，其特征在于，所述的载体为pEASY-Blunt-PhDof4或PhDof4-RNAi。


5.权利要求1所述的矮牵牛花药发育相关基因PhDof4在调控植物花药育性或植物形态中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的花药发育相关基因PhDof4在调控植物花药育性中的应用，包括如下步骤：
1)构建含有矮牵...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳远征，杜菊花，宾婧，李娅，杨秀莲，王良桂，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32