一种矮牵牛花器官发育基因PhDof28及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种矮牵牛花器官发育基因PhDof28及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术从矮牵牛中克隆了1个可能在花器官发育中发挥重要调控作用的基因PhDof28，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，表达蛋白如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术通过构建植物表达载体pCAMBIA2300‑PhDof28转化矮牵牛和烟草中，发现PhDof28基因在CaMV35S启动子的驱动下超量表达，大量合成的PhDof28基因促使矮牵牛花冠增大，花托增长，烟草花冠直径增大，花色加深，表明PhDof28基因在调控花器官发育方面发挥了重要作用。本发明专利技术为改良植物花器官发育，提高观赏性提供了新的基因资源。

A petunia flower organ development gene phdof28 and its application

【技术实现步骤摘要】
一种矮牵牛花器官发育基因PhDof28及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，更具体地说，涉及一种矮牵牛花器官发育基因PhDof28及其应用。
技术介绍
Dof基因家族蛋白是植物特有的一类转录调控因子，除了与本家族蛋白互作，还与其它家族蛋白成员互作，其在植物组织分化、种子发育、逆境胁迫、植物生理代谢等方面具有重要的调控作用。自1993年从玉米中鉴定报道了第一个ZmDof1(MNB1a)转录因子以来，已在多种单子叶植物和双子叶植物中发现了Dof基因。其中拟南芥基因组中存在37个Dof基因(Yanagisawa，2002)，水稻基因组中存在30个(Lijavetzkyetal，2003)，大麦中有26个(Moreno-Risuenoetal，2007b)，大豆中有28个(Wangetal，2007)，南瓜(Kisuetal，1998)、烟草(Baumannetal，1999)、小麦(Chenetal，2005)和马铃薯(Pleschetal，2001)等植物中也都存在Dof基因。Dof蛋白一般由200～400个氨基酸组成，具有特异和高度保守的DNA结合域，即位于N末端由52个氨基酸组成的Dof域。Dof蛋白以其Dof结构域与不同的植物特异性基因的启动子相互作用，在每一个Dof蛋白的DNA结合序列中均存在有AAAG序列。AAAG序列和其反向互补序列CTTT是Dof蛋白识别的核心序列。除了Dof结构域外，Dof蛋白包含的另一个主要的结构域是位于C末端的调控结构域。与保守的Dof结构域不同，转录调控结构域的氨基酸序列较为多变，不具保守性，它很可能通过与不同类型调控蛋白或物质的反应，受不同途径信号的调控而激活或抑制基因的转录。这种多样性可能是Dof功能多样性的基础之一。矮牵牛(Petuniahybrida)属茄科(Solanaceae)碧冬茄属(Petunia)，是世界上最重要的园艺观赏植物之一，因生长周期短，遗传背景清晰，生长周期短，可进行种子、扦插、嫁接等繁殖，一直以来作为研究花卉基因功能与花发育分子机制的模式植物。从矮牵牛中分离并克隆相关的基因Dof基因并揭示其功能，有利于研究Dof基因家族在植物生长发育中的分子调控机理，以进一步应用于植物的性状改良。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种矮牵牛花器官发育基因PhDof28。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供前述矮牵牛花器官发育基因PhDof28的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种矮牵牛花器官发育基因PhDof28，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的矮牵牛花器官发育基因PhDof28的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。含有所述的矮牵牛花器官发育基因PhDof28的载体、重组菌或细胞。进一步地，所述的矮牵牛花器官发育基因PhDof28的载体，为植物表达载体。进一步地，所述的植物表达载体为pCAMBIA2300-PhDof28。所述的矮牵牛花器官发育基因PhDof28，在改良植物花观赏性状中的应用。进一步地，所述的应用，包括以下步骤：1)构建矮牵牛花器官发育基因PhDof28的载体；2)将所构建的矮牵牛花器官发育基因PhDof28的载体转化到植物或植物细胞中；3)培育筛选得到花冠直径变大、花朵变长或花色加深的转基因植株。所述的应用中，所述的植物为矮牵牛或烟草。所述的应用中，所述的矮牵牛花器官发育基因PhDof28的载体为pCAMBIA2300-PhDof28。有益效果：相比于现有技术，本专利技术的优点为：(1)本专利技术提供的矮牵牛花器官发育基因PhDof28是一个新的花发育基因，该基因可调控植物花器官的发育，可改变植物花器官大小尤其是花瓣大小，从而可应用于转基因改良植物的观赏性状；(2)本专利技术为探究Dof转录因子在花瓣伸展过程中的调控关系，加深对花瓣大小调控网络的认知奠定了分子基础，提供了新的基因资源。附图说明图1为PhDof28基因全长扩增图；图2为pCAMBIA2300-PhDof28超表达载体阳性检测结果图；图3为PhDof28基因亚细胞定位图；图4为转PhDof28基因矮牵牛植株PCR阳性检测结果图；图5为超量表达PhDof28基因的转基因矮牵牛96号株系的表型图；注：A为花冠，B为花朵，C为花梗，D为花药；E为柱头，F为花萼；图6为矮牵牛花瓣明显伸长部位图；图7为转PhDof28基因烟草植株PCR阳性检测结果图；图8为烟草转PhDof28基因阳性株系进行半定量分析结果图；图9为转基因烟草不同花期PhDof28基因Real-TimePCR表达分析结果图；图10为超量表达PhDof28的转基因烟草31株系的表型图；图11为PhDof28转基因烟草28株系和31株系扫描电镜分析图；注：花瓣图片展示扫描电镜取样部位；up指花瓣上半部分细胞形态；mid指花瓣中部分细胞形态；down指花瓣下半部分细胞形态。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。实施例1：矮牵牛花器官发育基因PhDof28的克隆实验材料：矮牵牛(Petuniahybrida)品种“幻想”由南京林业大学风景园林学院重点实验室提供，播种于南京林业大学风景园林学院生长室，自然条件下生长。基因来源：基于前期课题组已有的矮牵牛花药转录组数据库(未发表)挑选而出并命名为PhDof28。矮牵牛总RNA中扩增PhDof28具体步骤为：1)按照北京艾德莱公司RNA提取试剂盒提取矮牵牛花组织样品总RNA，然后用1.0％琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测所提RNA质量及浓度。2)按照北京全式金反转录试剂盒将稀释十倍的矮牵牛总RNA反转录为cDNA，存于-20℃备用；反转录体系：反转录体系(20μL)：1μLgDNARemover，1μLAnchoredOligo(dt)18Primer(0.5μg/pL)，1μLRT/RIEnzymeMix，10μL2×TXReactionMix，7μLTotalRNA。反转录反应条件：42℃30min，85℃5s。3)用PrimerPremier5设计扩增引物，如下：上游引物PhDof28-F：5′-GCTAAGGTGAAGTTTTCATAATTGT-3′；下游引物PhDof28-R：5′AAAAAGGAGAGATATAGATCAAGGTAG-3′。按照北京TaKara生物技术有限公司的PrimeSTAR高保真酶进行目的基因全长扩增，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并进行产物回收，得到DNA全长片段(图1)。扩增全长基因反应体系(20μL)具体为：1μLcDNA，1μLantisensePrimer(PhDof28-F)(10mM)，1μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种矮牵牛花器官发育基因PhDof28，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种矮牵牛花器官发育基因PhDof28，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的矮牵牛花器官发育基因PhDof28的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.含有权利要求1所述的矮牵牛花器官发育基因PhDof28的载体、重组菌或细胞。


4.根据权利要求3所述的矮牵牛花器官发育基因PhDof28的载体，其特征在于，所述的载体为植物表达载体。


5.根据权利要求4所述的矮牵牛花器官发育基因PhDof28的载体，其特征在于，所述的植物表达载体为pCAMBIA2300-PhDof28。


...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳远征，杜菊花，史俐莎，刘家伟，杨秀莲，王良桂，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32