一种软骨祖细胞培养基及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种软骨祖细胞培养基，由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、FGF2、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和GSK‑3α/β抑制剂组成。通过混合各组分，再调节混合物pH和渗透压后灭菌处理制得。本发明专利技术为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，使其具有优异的自我更新能力。因未使用动物源成分，有效规避因此而造成污染的发生，完全避免诱发免疫反应的发生。培养基制备方法步骤简单、原料易得，不含血清，可保持CPCs的未分化、多能状态，专用于软骨祖细胞培养与扩增。本发明专利技术是一个长久持续高效的CPCs培养系统，使体外稳定繁殖功能性小鼠和人软骨祖细胞成为可能。

A culture medium for chondroprogenitor cells and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种软骨祖细胞培养基及其制备方法和应用
本专利技术属于培养基领域，具体地，涉及一种软骨祖细胞培养基及其制备方法和应用。
技术介绍
透明关节软骨作为滑膜关节的重要组成部分，具有维持骨骼的灵活性和关节的平滑性的功能。成年后，关节软骨细胞作为软骨细胞的一个亚群，缓慢维持着软骨组织的稳定。肥大软骨细胞与关节软骨细胞不同，其存在于生长板中，其功能是骨形成过程中产生新的软骨。为了治疗退行性关节疾病，用体外产生的细胞或组织替代关节软骨细胞或关节软骨为目前的主要治疗选择——全关节置换提供了一个全新的可选方案。而对于不同的细胞治疗而言，确保干细胞或祖细胞的良好来源是解决这一问题的关键。迄今为止，针对退行性关节疾病的组织工程解决方案的研究主要集中在成熟的关节软骨细胞、间充质干细胞和多能干细胞(PSCs)，软骨祖细胞(CPC)的相关研究较少。PSCs为软骨细胞的产生提供了一个有吸引力的细胞来源。胚胎干细胞(ESCs)已经在诸多文献中证明可以通过生长因子的调控，先向中胚层细胞分化，进而分化为软骨细胞分。然而，这些分化方案所产生的软骨细胞样细胞数量非常少需要进一步的改良。最新的研究表明，胎儿组织是干细胞治疗的一个非常有前途的细胞来源。我们和其他人已经从许多胎儿组织中分离出多种干细胞群，包括血、肺、肝、肾、脑和脐带。与成体干细胞相比，这些胚胎来源的干细胞具有更高的增殖潜能和更强的多能性。同时，它们在致瘤性和免疫应答方面的问题也较少。大量研究表明，许多组织中都包含有大量的干细胞组织，文献报道显示软骨组织中也包含有祖细胞样细胞。许多研究小组已经在人类、马和牛的成年关节软骨中发现鉴定了CPCs。CPCs具有多向分化潜力并且其细胞表面具有特异性标志物(例如CD105,CD166和STRO-1)，但总的来说他们的起源和功能尚需进一步证明。重要的是，由于以下原因，目前分离到的CPCs并不适合用于软骨退变治疗。首先，大多数研究人员在GA≥8周时分离出hCPCs，此时大多数hCPCs可能已经沿着软骨细胞谱系进展。Quintin等人报道说，在GA14-16周分离的细胞可以向软骨谱系分化，但不能向下分化成骨或脂肪。其次，由于细胞传代的限制，不能产生足够数量的细胞用以进一步软骨修复。因此，必须进一步研究获取能够促进CPCs长期持久自我更新的培养条件。第三，CPCs在体内的成功移植尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种软骨祖细胞培养基，所述软骨祖细胞培养基由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和GSK-3α/β抑制剂组成。上述原料的含量可以在一定的范围内选择，在本专利技术的一种优选的实施方式中，为了使得细胞在培养过程中能够具有更为稳定的培养环境，所述DMEM培养基与所述F12培养基的含量的体积比为1：0.5-2；且以实际所需所述培养基的总体积为基准，所述维生素C的浓度为50-200μg/mL，所述胰岛素生长因子的浓度为1-150ng/mL，所述FGF2的浓度为1-150ng/mL，所述GSK-3α/β抑制剂的浓度为1-30uM，所述转铁蛋白的浓度为5-100μg/mL，所述ROCK抑制剂的浓度为1-50uM，所述p38抑制剂的浓度为1-20uM，所述脯氨酸的浓度为0-10mM，所述丙酮酸钠的浓度为1-15mM。本专利技术的另一个目的是提供所述髓核祖细胞培养基的制备方法，通过以下步骤实现：1)将DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂(Y27632)、GSK-3α/β抑制剂、p38MAPK抑制剂，制得混合物M1；2)将混合物M1调节pH和渗透压，得到混合物M2；3)将混合物M2进行灭菌处理，制得软骨祖细胞培养基。上述中的信号通路抑制剂可以选自本领域技术人员能够理解和使用的类型，当然在我们的实施方式中，为了使其具有良好的调控效果，所述GSK-3α/β抑制剂选自牌号为CHIR99021的GSK-3α/β抑制剂，所述ROCK抑制剂选自牌号为Y27632的ROCK抑制剂，所述p38抑制剂为选自牌号为SB202190的p38抑制剂。步骤2)中调节pH的操作可以采用本领域技术人员能够理解的方式进行操作，例如，可以采用加入酸碱调节剂进行调节，在本专利技术的一种优选的实施方式中，步骤2)中为加入碱调节pH值。这里的碱可以选自本领域技术人员能够理解和使用的类型，例如，一种更为优选的实施方式中，所述碱选自氢氧化钠。当然，调节后的pH值可以在一定的范围内选择，例如，一种优选的实施方式中，为了进一步保证培养环境的稳定性，混合物M2的pH值为7.3-7.5。进一步优选的实施方式中，混合物M2的渗透压为330-360mOsm/kg。步骤3)中灭菌处理能够采用本领域技术人员所能够理解的方式进行操作，例如，在本专利技术的一种优选的实施方式中，步骤3)中灭菌处理选自射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌中的至少一种。进一步优选的实施方式中，灭菌处理采用湿热灭菌。更为优选的实施方式中，灭菌处理为通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌。本专利技术的再一个目的是提供所述一种软骨祖细胞培养基在培养人软骨祖细胞向多种细胞分化中的应用。通过上述技术方案，本专利技术提供的细胞培养基通过DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂(Y27632)、GSK-3α/β抑制剂、p38MAPK抑制剂的协同作用以向培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，使得培养细胞具有优异的自我更新能力。同时该培养基中未使用动物源成分，进而有效地规避了由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生，并且能够在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应的发生。另外，该细胞培养基的制备方法步骤简单、原料易得，不含血清，专门用于软骨祖细胞的培养与扩增。该培养基可保持CPCs的未分化、多能状态。本专利技术基于前期基础，探索一个长久持续高效的CPCs培养系统，使稳定的体外繁殖的功能性的小鼠和人软骨祖细胞成为可能。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明图1-A.E11.5Sox9GFP+小鼠胚胎CPCs分离及培养条件筛选示意图。图1-B.在CPSR培养基中指定传代培养的mCPC的亮场图像。比例尺＝100μm。图1-C.经过20次传代后的mcpc数量(从100,000个细胞开始)。图1-D.SOX9-GFP细胞的流式细胞仪分析(显示细胞类型)。图1-E(1).对指示的表面标记物进行FACS分析。图1-E(2).对指示的表面标记物进行FACS分析。图1-F.WB分析传代培养的m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种软骨祖细胞培养基，其特征在于，所述培养基由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和GSK-3α/β抑制剂组成，其中DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：0.5-2。/n

【技术特征摘要】
1.一种软骨祖细胞培养基，其特征在于，所述培养基由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和GSK-3α/β抑制剂组成，其中DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：0.5-2。


2.根据权利要求1所述的一种软骨祖细胞培养基，其特征在于，以所述培养基的总体积为基准，所述培养基维生素C的浓度为50-200μg/mL，所述胰岛素生长因子的浓度为1-150ng/mL，所述FGF2的浓度为1-150ng/mL，所述GSK-3α/β抑制剂的浓度为1-30uM，所述转铁蛋白的浓度为5-100μg/mL，所述ROCK抑制剂的浓度为1-50uM，所述p38抑制剂的浓度为1-20uM，所述脯氨酸的浓度为0-10mM，所述丙酮酸钠的浓度为1-15mM。


3.根据权利要求1或2所述的一种软骨祖细胞培养基的制备方法，替特征在于，通过以下步骤实现：
(1)将DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2、转铁蛋白、ROCK抑制剂、GS...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁成振，夏楷顺，李中伟，李荣辉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33