一种EB病毒的检测引物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种EB病毒的检测引物，属于基因检测技术领域，所述检测引物包括扩增EB病毒基因的正向引物、反向引物及MGB探针引物，本发明专利技术采用数字PCR技术检测EB病毒，设计的引物和MGB探针可以扩展适用于其它数字PCR系统；可检测出低浓度的EB病毒核酸样本，具有很高的特异性及灵敏度，引物扩增效率高，将极大地提高EB病毒的检出率，为临床检测EB病毒提供一种可靠方法。

A primer for EB virus detection and its kit

【技术实现步骤摘要】
一种EB病毒的检测引物及其试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，尤其是涉及数字PCR检测人类EB病毒的引物及其试剂盒。
技术介绍
EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)是一种嗜淋巴上皮性γ-1疱疹病毒，全世界有超过90％的人感染这种病毒。在大部分个体中，EB病毒可导致终生无症状感染，然而在少数具免疫力的个体中，该病毒与包括传染性单核细胞增多症在内的几种良性和恶性增殖性疾病有关，如霍奇金淋巴瘤，B细胞和T细胞非霍奇金淋巴瘤，鼻咽癌及胃癌。在免疫缺陷患者中，EB病毒激活感染是移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)、艾滋病相关淋巴瘤和X-连锁增殖性综合症发生的重要危险因素。在获得性免疫缺陷综合症患者中，约30％的成球细胞和高达90％的免疫细胞性淋巴瘤中发现了EB病毒感染。除了其公认的致瘤作用外，EB病毒也一直是疾病监测的目标。在移植受者中，对外周血EB病毒载量的纵向监测日益被认为是预测、诊断和治疗PTLD的有价值的诊断工具。目前，荧光定量PCR(Quantitativerealtimepolymerasechainreaction，QPCR)是检测定量EB病毒使用的比较多的技术手段，该技术通过在PCR反应体系中加入荧光标记的探针(如TaqMan)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，以此来评估PCR的扩增效果。荧光定量PCR主要依赖于校准物制备的标准曲线，进而确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。该技术存在众多不足：1.校准品和样品间背景的差异易影响PCR的效率和测量响应；2.低拷贝数的目标DNA分子不能通过扩增检测到；3.样品的PCR扩增效率可能与校准物的扩增效率不同；4.DNA提取时引入DNA溶液的杂质或者DNA降解影响了PCR动态扩增过程。因此，荧光定量PCR很难达到对低拷贝值EB病毒的检测与绝对定量。数字PCR(digitalpolymerasechainreaction，dPCR)是一项针对单分子靶标DNA的绝对定量技术。该技术是将含有DNA模板的PCR溶液稀释后分布到大量的独立反应室(如芯片)，液体分子遵从泊松分布，单分子间通过稀释分离，并且独自进行PCR扩增，这种样品的分配可以极大降低本底信号的影响，提高低丰度靶标的扩增灵敏度，最后分析每个扩增产物，通过泊松概率分布公式计算出DNA模板的原始拷贝数而不需要采用参考标准物或者外标。准确的定量依赖于40～45个循环的扩增，假阴性检出水平(单DNA模板出现在反应室而未被检出)非常低。其具有操作方便、检测通量高、特异性强、灵敏度高、定量准确等优点。数字PCR作为DNA定量的新技术，克服了实时荧光定量PCR的一系列缺点，实现了单分子DNA绝对定量。避免了荧光定量PCR使用标准曲线对测量结果产生影响等问题。此技术可代替荧光定量PCR应用于EB病毒的定量检测。
技术实现思路
基于上述技术问题，本专利技术提供了一组特异性强，扩增效率高的PCR引物及MGB探针，再结合高灵敏度的数字PCR技术，以达到检测和绝对定量低拷贝值EB病毒的目的。MGB探针是在普通探针的基础上设计了非荧光淬灭基团，降低了本底信号强度。同时MGB基团对DNA双链小沟具有高亲和性，提高了检测的特异性和信噪比，又降低了检测成本。在本专利技术中，MGB探针的Tm值特异地统一设计为70℃，而PCR扩增引物特异地统一设计为60℃，使得MGB探针能够特异地结合到PCR扩增产物序列中。在PCR扩增过程中，利用Taq酶5’-3’外切酶特点，水解MGB探针，产生荧光信号。即本专利技术提供了一种EB病毒的检测引物，所述检测引物包括EB病毒的正向引物、反向引物以及MGB探针引物。优选地，所述正向引物及反向引物对应于EB病毒基因14612-14631和14691-14707处碱基，序列来源于PubmedEB基因组。优选地其序列如SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示，EB病毒基因组编号NCBI编码为GenBank:AJ507799.2。优选地，所述MGB探针引物对应于EB病毒基因14649-14672处碱基，其序列如SEQIDNO.：3所示。EB病毒基因组编号NCBI编码为GenBank:AJ507799.2。所述引物扩增基因序列对应于EB病毒基因14612-14707碱基，扩增片段大小为96个碱基，如SEQIDNO.：4所示。在上述的EB病毒检测引物中，所述EB病毒引物序列选自PubMed数据库中EB病毒基因14612-14631和14691-14707碱基，其序列如SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示。其引物3’端无连续的G或C碱基聚集，3’端不存在自身互补重叠序列，可避免发夹结构和引物二聚体的产生。在上述的EB病毒检测引物中，所述正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示。EB-正向：GGTATCGGGCCAGAGGTAAG(SEQIDNO.001)EB-反向：CTGAGACGGGTGGGTGTG(SEQIDNO.002)所述MGB探针引物序列如SEQIDNO.：3所示。EB探针：FAM-CTAAGCCCAACACTCC-MGB(SEQIDNO.003)所述扩增区域序列如SEQIDNO.：4所示。引物扩增序列：GGTATCGGGCCAGAGGTAAGTGGACTTTAATTTTTTCTGCTAAGCCCAACACTCCACCACACCCAGGCACACACTACACACACCCACCCGTCTCAG(SEQIDNO.004)设计的MGB探针引物利用FAM荧光染料进行5’端修饰如SEQIDNO.：003所示，荧光信号强，检测效率最高。在上述的EB病毒检测引物中，所述检测引物的使用方法：1)提取样品DNA；2)利用SEQIDNO.：001-003所示的正、反向扩增引物及MGB探针引物，对步骤1)所述DNA样品利用芯片PCR扩增仪进行扩增，获得EB病毒的扩增产物；3)利用生物芯片阅读仪对步骤2)所述扩增产物进行扫描和分析，获得所述扩增产物的拷贝值。本专利技术还提供了一种检测人类EB病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的检测引物。进一步地，所述检测试剂盒包括样品DNA抽提试剂、70％乙醇、异丙醇、检测体系PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括：1对扩增引物和1条MGB探针引物，序列如SEQIDNO.：001-003所示。优选地，所述检测体系PCR反应液还包括：PCR扩增缓冲液和PCR聚合酶，例如商用试剂盒中，2xMultiplexPCRPlusBuffer；dNTPMix；HotStarTaqPlusDNAPolymerase。本专利技术设计了检测EB病毒的正、反向引物及MGB探针引物，可同时用于荧光定量PCR及数字PCR扩增反应。通过荧光定量PCR扩增对比发现其扩增效率高于其它引物。对质粒标准品及送检样本进行数字P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EB病毒的检测引物，其特征在于，所述检测引物包括EB病毒的正向引物、反向引物以及MGB探针引物，所述EB病毒引物序列来源于国际PubMed数据库中EB病毒基因组。/n

【技术特征摘要】
1.一种EB病毒的检测引物，其特征在于，所述检测引物包括EB病毒的正向引物、反向引物以及MGB探针引物，所述EB病毒引物序列来源于国际PubMed数据库中EB病毒基因组。


2.根据权利要求1所述检测引物，其特征在于，所述正向引物及反向引物对应于EB病毒基因14612-14631和14691-14707碱基，EB病毒基因组编号NCBI编码为GenBank:AJ507799.2。


3.根据权利要求2所述检测引物，其特征在于，所述正向引物及反向引物的序列如SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示。


4.根据权利要求1所述检测引物，其特征在于，EB病毒基因组编号NCBI编码为GenBank:AJ507799.2，所述MGB探针引物对应于EB病毒基因14649-14672处碱基。


5.根据权利要求4所述检测引物，其特征在于，所述MGB探针引物的序列如SEQIDNO.：3所示。
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【专利技术属性】
技术研发人员：钱学庆，秦炜，宋成林，贺笑非，吴小虎，胡雄敏，崔丹，杨觐瑜，赵垠莹，侯隽杰，
申请(专利权)人：上海润达榕嘉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31