副溶血弧菌的核酸快速恒温检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种针对副溶血弧菌的快速恒温检测方法、引物组、试剂盒及应用。所述方法为：从待测样品中提取基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，以能扩增副溶血弧菌特异性序列的引物组为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在副溶血弧菌。本发明专利技术检测方法具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低，具广泛应用前景。

Rapid and constant temperature detection of nucleic acid of Vibrio parahaemolyticus and its application

【技术实现步骤摘要】
副溶血弧菌的核酸快速恒温检测方法及应用本申请是2016年8月30日提交的、申请号为201610780447.4、专利技术名称为：“快速恒温检测副溶血弧菌的方法、引物及应用”的中国专利技术专利申请的分案申请；该母案申请要求申请日为2015年9月2日、申请号为201510556917.4、专利技术名称为“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国专利技术专利申请的优先权。
本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速恒温检测副溶血弧菌的方法、引物及试剂盒。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，广泛分布于江河、海洋及热带和温带沿海地区，主要寄生于浮游生物、鱼、虾蟹、贝类等水产品中，直接或间接食用被该菌污染的食品会引发腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症。副溶血弧菌发病呈世界性分布，尤其在沿海地区发病率较高，在我国沿海城市副溶血性弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒事件中所占比例已经超过沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌等，位居首位。因此，对于该菌的检测和预防都具有重要意义。目前，国内外针对副溶血弧菌的检测方法仍以常规培养方法作为标准，其检测周期较长(达5-7天)，操作相对复杂，检测效率较低，难以满足现代社会对于食源性致病菌检测过程高通量、高灵敏度、高特异性、快速、便捷的要求。近年来随着核酸分子检测技术的发展，以特异性基因为靶标建立的PCR技术已经成功应用于副溶血弧菌的检测，具有灵敏度高，检测时间短等优点，但该方法必须配备专门的仪器设备，并且需要专业的操作人员。因此，并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。为确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的副溶血性弧菌。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,AminoN,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,NucleicAcidsResearch,2000Jun15；28(12):E63)。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。引物设计是LAMP技术中最为关键的一步，常规做法是将某待检测生物的公认的特异性基因导入LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e)，设定相关参数生成引物组。也就是说，用户首先必须确保该靶基因为待测物种的特异序列。以专利技术专利ZL201210062791.1和CN104513857A为例，它们分别针对文献报道的副溶血弧菌的特异基因——tlh和irgB序列，采用LAMP技术进行副溶血弧菌检测。然而，所谓“公认的特异性基因”往往基于滞后的知识，并未基于不断增长的微生物基因组数据进行必要的更新，导致基于该靶基因序列获得的引物在实际应用中不一定能确保其通用性和/或特异性。本专利技术用表1展示了现有技术中存在的引物通用性不能确保的问题。也就是说，现有技术方法中所使用的副溶血弧菌检测序列实际上并非副溶血弧菌所共有，即，有可能漏检副溶血弧菌的部分菌株。类似的问题也存在于特异性的确认，即，有可能将非副溶血弧菌错误地认定为副溶血弧菌。因此，行业内亟需一种能够确保特异性和通用性的副溶血弧菌检测方法，同时满足基层检测部门对快速、便捷的需求，能够方便地在企业生产线内部开展实时实地检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有LAMP技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别副溶血弧菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本专利技术基于GenBank数据库中的微生物基因组数据资源(截至2013年8月5日数据)进行副溶血弧菌LAMP引物的设计，提供了一种快速恒温扩增检测副溶血弧菌的方法、引物组及试剂盒。采用本专利技术的检测方法检测副溶血弧菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。本专利技术提出一种快速检测副溶血弧菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从待测样品中提取基因组DNA；(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增副溶血弧菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物，在酶反应体系下，进行恒温扩增反应；(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在副溶血弧菌。本专利技术恒温检测副溶血弧菌菌株的方法，从待测样品中提取基因组DNA，以其为模板，以副溶血弧菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应，然后，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在副溶血弧菌。其中，所述酶反应体系包括但不限于DNA聚合酶反应体系。本专利技术中，所述副溶血弧菌基因组特异性碱基序列为GI号为28899855的副溶血弧菌的22268～23012bp位序列。本专利技术中，所述能扩增副溶血弧菌基因组特异性碱基序列的引物组为所述基因组(GI号为28899855)的22268～23012bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。其中，所述副溶血弧菌基因组特异性碱基序列是指仅为副溶血弧菌基因组所特有的，而其它微生物基因组所不包含的碱基序列。其中，所述能扩增副溶血弧菌基因组特异碱基序列的引物组包括但不限于选自以下各引物组A～B之任意一组，或选自与该引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的引物组之任意一组。引物组A：上游外引物F3_A：5’-TGAGTAGCGGTTCAATCG-3’(SEQIDNO：1)；下游外引物B3_A：5’-CGAGAAGTAAGGAAGTCTCT-3’(SEQIDNO：2)；上游内引物FIP_A：5’-CAAACTAACGCTTATAACCAACAGCATAGTTTTTCAGCTCGGC-3’(SEQIDNO：3)；下游内引物BIP_A：5’-ACATCATACCTAGTGCAATGGTGACCATAAGAAAGCGACTGTA-3’(SEQIDNO：4)；引物组B：上游外引物F3_B：5’-TGGAAAGAATATACAGTCGC-3’(SEQIDNO：5)；下游外引物B3_B：5’-GGTAATTGTGATCACGCTT-3’(SEQIDNO：6)；上游内引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对副溶血弧菌的快速恒温检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)从待测样品中提取基因组DNA；/n(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增副溶血弧菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；/n(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在副溶血弧菌；/n其中，所述副溶血弧菌基因组特异性碱基序列为GI号为28899855的副溶血弧菌基因组的22268～23012bp位序列；/n其中，所述能扩增副溶血弧菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下引物组C、D、D’之任意一组；/n引物组C：/n上游外引物F3_C：5’-TCTTGAGTAGCGGTTCAA-3’(SEQ ID NO：9)；/n下游外引物B3_C：5’-GGAAGTCTCTATGAATCTAACC-3’(SEQ ID NO：10)；/n上游内引物FIP_C：5’-ATTGATCAGACCCACACCACGAACATAGTTTTTCAGCTCG-3’(SEQ ID NO：11)；/n下游内引物BIP_C：5’-TAGGTGAACCACATCATACCTAGTGCGACTGTATATTCTTTCCA-3’(SEQ IDNO：12)；/n引物组D：/n上游外引物F3_D：5’-TGGAAAGAATATACAGTCGC-3’(SEQ ID NO：13)；/n下游外引物B3_D：5’-CTGCTCTCGGTAATTGTG-3’(SEQ ID NO：14)；/n上游内引物FIP_D：5’-GGCAAATCGATTGAATTTTGCCGGTTAGATTCATAGAGACTTCC-3’(SEQ IDNO：15)；/n下游内引物BIP_D：5’-GCAGATTAACCGACTTAGTAGGATGTTAATACGCTCGCGATA-3’(SEQ IDNO：16)；/n引物组D’：/n上游外引物F3_D：5’-TGGAAAGAATATACAGTCGC-3’；/n下游外引物B3_D：5’-CTGCTCTCGGTAATTGTG-3’；/n上游内引物FIP_D：5’-GGCAAATCGATTGAATTTTGCCGGTTAGATTCATAGAGACTTCC-3’；/n下游内引物BIP_D：5’-GCAGATTAACCGACTTAGTAGGATGTTAATACGCTCGCGATA-3’；/n下游环引物LB_D：5’-AGAAGTACTGGAAATGCACGAT-3’(SEQ ID NO：19)。/n...

【技术特征摘要】
20150902 CN 20151055691741.一种针对副溶血弧菌的快速恒温检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增副溶血弧菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；
(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在副溶血弧菌；
其中，所述副溶血弧菌基因组特异性碱基序列为GI号为28899855的副溶血弧菌基因组的22268～23012bp位序列；
其中，所述能扩增副溶血弧菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下引物组C、D、D’之任意一组；
引物组C：
上游外引物F3_C：5’-TCTTGAGTAGCGGTTCAA-3’(SEQIDNO：9)；
下游外引物B3_C：5’-GGAAGTCTCTATGAATCTAACC-3’(SEQIDNO：10)；
上游内引物FIP_C：5’-ATTGATCAGACCCACACCACGAACATAGTTTTTCAGCTCG-3’(SEQIDNO：11)；
下游内引物BIP_C：5’-TAGGTGAACCACATCATACCTAGTGCGACTGTATATTCTTTCCA-3’(SEQIDNO：12)；
引物组D：
上游外引物F3_D：5’-TGGAAAGAATATACAGTCGC-3’(SEQIDNO：13)；
下游外引物B3_D：5’-CTGCTCTCGGTAATTGTG-3’(SEQIDNO：14)；
上游内引物FIP_D：5’-GGCAAATCGATTGAATTTTGCCGGTTAGATTCATAGAGACTTCC-3’(SEQIDNO：15)；
下游内引物BIP_D：5’-GCAGATTAACCGACTTAGTAGGATGTTAATACGCTCGCGATA-3’(SEQIDNO：16)；
引物组D’：
上游外引物F3_D：5’-TGGAAAGAATATACAGTCGC-3’；
下游外引物B3_D：5’-CTGCTCTCGGTAATTGTG-3’；
上游内引物FIP_D：5’-GGCAAATCGATTGAATTTTGCCGGTTAGATTCATAGAGACTTCC-3’；
下游内引物BIP_D：5’-GCAGATTAACCGACTTAGTAGGATGTTAATACGCTCGCGATA-3’；
下游环引物LB_D：5’-AGAAGTACTGGAAATGCACGAT-3’(SEQIDNO：19)。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶反应体系包括：1×BstDNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/LMg2+，1.0-1.6mmol/LdNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μLBstDNA聚合酶，0-1.5mol/L的甜菜碱，包括或不包括0.4-1.0μmol/L的LF或LB引物。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增反应的反应程序为：①60～65℃孵育10～90min；②80℃终止反应2～20min。


4.用于针对副溶血弧菌的快速恒温检测的引物，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永梅，李园园，李雪玲，韦朝春，贾犇，刘伟，陆长德，李亦学，
申请(专利权)人：上海旺旺食品集团有限公司，上海产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31