本发明专利技术公开了一种针对单核细胞增生李斯特菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒。所述方法为：从待测样品中提取基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，以能扩增单核细胞增生李斯特菌特异性序列的引物组为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌。本发明专利技术检测方法具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低，具广泛应用前景。
Rapid and constant temperature detection method, primer set and kit for Listeria monocytogenes
【技术实现步骤摘要】
单核细胞增生李斯特菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒本申请是2016年8月30日提交的、申请号为201610767426.9、专利技术名称为：“快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物及试剂盒”的中国专利技术专利申请的分案申请；该母案申请要求申请日为2015年9月2日、申请号为201510556917.4、专利技术名称为“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国专利技术专利申请的优先权。
本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物及试剂盒。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阳性短杆菌，在肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品和蔬菜中均可能存在。它能引起人类和动物李斯特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重。1986年，世界卫生组织(WHO)将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一；2000年，WHO又将其列为需要重点监测的食源性致病菌之一。目前，国内外对于单核细胞增生李斯特菌的检测主要还是培养法和血清学的检测方法，包括富集、选择性培养、生化鉴定。这些传统检测方法具有劳动强度高、耗时、费用高等缺点。更重要的是，传统方法检测灵敏度较低、特异性不足，尤其对于来源相近的菌株，传统方法很难加以区分。因此，为了确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的单核细胞增生李斯特菌。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,AminoN,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,NucleicAcidsResearch,2000Jun15；28(12):E63)。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。引物设计是LAMP技术中最为关键的一步，常规做法是将某待检测生物的公认的特异性基因导入LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e)，设定相关参数生成引物组。也就是说，用户首先必须确保该靶基因为待测物种的特异序列。以专利技术专利ZL201410632370.7和ZL201310353402.5为例，它们分别针对文献报道的单核细胞增生李斯特菌的特异基因——hlyA基因和prfA基因，采用LAMP技术进行单核细胞增生李斯特菌检测。然而，所谓“公认的特异性基因”往往基于滞后的知识，并未基于不断增长的微生物基因组数据进行必要的更新，导致基于该靶基因序列获得的引物在实际应用中不一定能确保其通用性和/或特异性。本专利技术用表1展示了现有技术中存在的引物通用性不够、同时特异性也不能确保的问题。也就是说，现有技术方法中所使用的单核细胞增生李斯特菌检测序列实际上并非单核细胞增生李斯特菌所特有，即，有可能将非单核细胞增生李斯特菌错误地认定为单核细胞增生李斯特菌；同时，现有技术方法中所使用的单核细胞增生李斯特菌检测序列也并非单核细胞增生李斯特菌所共有，即，有可能漏检单核细胞增生李斯特菌中的部分菌株。因此，行业内亟需一种能够同时确保特异性和通用性的单核细胞增生李斯特菌检测方法，同时满足基层检测部门对快速、便捷的需求，能够方便地在企业生产线内部开展实时实地检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有LAMP技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别单核细胞增生李斯特菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本专利技术基于GenBank数据库中的微生物基因组数据资源(截至2013年8月5日数据)进行单核细胞增生李斯特菌LAMP引物的设计，提供了一种快速恒温扩增检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物组及试剂盒。采用本专利技术的检测方法检测单核细胞增生李斯特菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。本专利技术提出一种快速检测单核细胞增生李斯特菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从待测样品中提取基因组DNA；(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增单核细胞增生李斯特菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物，在酶反应体系下，进行恒温扩增反应；(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌。本专利技术恒温检测单核细胞增生李斯特菌菌株的方法，从待测样品中提取基因组DNA，以其为模板，以单核细胞增生李斯特菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应，然后，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌。其中，所述酶反应体系包括但不限于DNA聚合酶反应体系。本专利技术中，所述单核细胞增生李斯特菌基因组特异性碱基序列为GI号为16802048的单核细胞增生李斯特菌的2418389～2418620bp位序列。本专利技术中，所述能扩增单核细胞增生李斯特菌基因组特异性碱基序列的引物组为所述基因组(GI号为16802048)的2418389～2418620bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。其中，所述单核细胞增生李斯特菌基因组特异性碱基序列是指仅为单核细胞增生李斯特菌基因组所特有的，而其它微生物基因组所不包含的碱基序列。其中，所述能扩增单核细胞增生李斯特菌基因组特异碱基序列的引物组包括但不限于引物组A，或与该引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为73.7％及以上的引物组之任意一组。引物组A：上游外引物F3_A：5’-TGAAAATCGGGGTAGCAAT-3’(SEQIDNO：1)；下游外引物B3_A：5’-GGGGAATCAAAACAGAATCC-3’(SEQIDNO：2)；上游内引物FIP_A：5’-AACGCAGAAGCATTAGTCACCGCCCGAACTTGATTCAAT-3’(SEQIDNO：3)；下游内引物BIP_A：5’-ATGCACTTCGATGATGTTCACTGGCTTACAGGATTAACTCAAC-3’(SEQIDNO：4)。本专利技术中，所述能扩增单核细胞增生李斯特菌基因组特异碱基序列的引物组还可以包括与前述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为73.7％及以上的引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种针对单核细胞增生李斯特菌的快速恒温检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能扩增单核细胞增生李斯特菌基因组特异性碱基序列的引物组，所述能扩增单核细胞增生李斯特菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物组A或引物组A’；/n引物组A：/n上游外引物F3_A：5’-TGAAAATCGGGGTAGCAAT-3’(SEQ ID NO：1)；/n下游外引物B3_A：5’-GGGGAATCAAAACAGAATCC-3’(SEQ ID NO：2)；/n上游内引物FIP_A：5’-AACGCAGAAGCATTAGTCACCGCCCGAACTTGATTCAAT-3’(SEQ ID NO：3)；/n下游内引物BIP_A：5’-ATGCACTTCGATGATGTTCACTGGCTTACAGGATTAACTCAAC-3’(SEQ IDNO：4)；/n引物组A’：/n上游外引物F3_A：5’-TGAAAATCGGGGTAGCAAT-3’；/n下游外引物B3_A：5’-GGGGAATCAAAACAGAATCC-3’；/n上游内引物FIP_A：5’-AACGCAGAAGCATTAGTCACCGCCCGAACTTGATTCAAT-3’；/n下游内引物BIP_A：5’-ATGCACTTCGATGATGTTCACTGGCTTACAGGATTAACTCAAC-3’；上游环引物LF_A：5’-GCGCATTCAGATATTCAATTGGC-3’(SEQ ID NO：9)；/n和/或，下游环引物LB_A：5’-CCATTCGTTACTAATTCATTTGCCG-3’(SEQ ID NO：10)。/n...
【技术特征摘要】
20150902 CN 20151055691741.一种针对单核细胞增生李斯特菌的快速恒温检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能扩增单核细胞增生李斯特菌基因组特异性碱基序列的引物组，所述能扩增单核细胞增生李斯特菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物组A或引物组A’；
引物组A：
上游外引物F3_A：5’-TGAAAATCGGGGTAGCAAT-3’(SEQIDNO：1)；
下游外引物B3_A：5’-GGGGAATCAAAACAGAATCC-3’(SEQIDNO：2)；
上游内引物FIP_A：5’-AACGCAGAAGCATTAGTCACCGCCCGAACTTGATTCAAT-3’(SEQIDNO：3)；
下游内引物BIP_A：5’-ATGCACTTCGATGATGTTCACTGGCTTACAGGATTAACTCAAC-3’(SEQIDNO：4)；
引物组A’：
上游外引物F3_A：5’-TGAAAATCGGGGTAGCAAT-3’；
下游外引物B3_A：5’-GGGGAATCAAAACAGAATCC-3’；
上游内引物FIP_A：5’-AACGCAGAAGCATTAGTCACCGCCCGAACTTGATTCAAT-3’；
下游内引物BIP_A：5’-ATGCACTTCGATGATGTTCACTGGCTTACAGGATTAACTCAAC-3’；上游环引物LF_A：5’-GCGCATTCAGATATTCAATTGGC-3’(SEQIDNO：9)；
和/或，下游环引物LB_A：5’-CCATTCGTTACTAATTCATTTGCCG-3’(SEQIDNO：10)。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其还包括BstDNA聚合酶反应缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTP溶液、Mg2+、甜菜碱中的一种或多种。
3.一种针对单核细胞增生李斯特菌的快速恒温检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的酶反应体系包括：1×BstDNA聚合酶反应缓冲液，2-9m...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟，李雪玲，李园园，贾犇，韦朝春，陆长德，李亦学，曹永梅，
申请(专利权)人：上海产业技术研究院，上海旺旺食品集团有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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