心肌细胞诱导和生长培养基制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，涉及心肌细胞诱导和生长培养基，公开了一个稳定、经济地生产心肌细胞的无血清生产方法，整套系统分为诱导分化系统(IS，induced system)和长期培养系统(LCS，long‑term culture system)。诱导分化系统的组分包括：氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、谷胱甘肽、HEPES、酚红、重组人白蛋白、抗坏血酸；长期培养体系的组分包括：氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、谷胱甘肽、HEPES、酚红、抗坏血酸、转铁蛋白、胰岛素、亚硒酸钠、脂质浓缩物。整套系统规避了常规不稳定的混合物添加剂的成分，提高了心肌细胞分化和培养的稳定性，且整套系统添加剂价格低廉，适用于大规模心肌细胞生产。

【技术实现步骤摘要】
心肌细胞诱导和生长培养基
本专利技术涉及生物
，尤其涉及心肌细胞诱导和生长培养基及其生产方法和应用。
技术介绍
人源心肌细胞在药物评价以及细胞治疗等方面具有广阔的应用前景。因心肌细胞增殖能力极弱，且人类心脏组织获取困难，由人多能干细胞分化获得心肌细胞成为获取人源心肌细胞的主要途径。心肌细胞分化研究已非常深入，通过操纵WNT信号通路即可成功诱导人多能干细胞分化形成心肌细胞，但心肌细胞的分化稳定性在不同体系中差异巨大。现有心肌细胞分化、培养技术往往通过配合添加胎牛血清、牛血清白蛋白或B27添加剂(B-27TMSupplement,minusinsulin(ThermoFisher，A1895601))实现，而这些添加剂在不同批次之间存在差异，导致心肌细胞分化的不稳定。此外，不同的人多能干细胞系在心肌生产方面也存在差异。当下的人多能干细胞分化心肌细胞体系普遍存在添加剂多的问题，导致心肌细胞生产成本昂贵、细胞分化不稳定以及细胞有添加剂成分残留等问题。因此，在开发心肌细胞培养体系时，需要注重剔除不稳定过成分以及对不同的细胞系开发不同的生产体系。
技术实现思路
本专利技术涉及一种经济的心肌细胞分化培养基和生长培养基。本专利技术的培养基使用化学成分明确的单一成分添加剂替换混合成分添加剂：在分化系统中，使用重组人白蛋白和抗坏血酸代替混合成分添加剂；在生长系统使用化学成分确定的脂质浓缩物以及胰岛素代替胎牛血清。解决了由混合成分添加剂带来的心肌细胞生产的不稳定性。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术第一方面提供一种诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的无血清分化培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、pH调节剂、白蛋白、抗坏血酸或由其组成。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含基础培养基、白蛋白和抗坏血酸。在一个或多个实施方案中，基础培养基选自以下的一种或多种：RPMI1640培养基、GlutaMAX、DMEM/F12。在一个或多个实施方案中，分化培养基是液体。在一个或多个实施方案中，抗坏血酸浓度为0.1-5g/L、0.1-4.5g/L、0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.1-1.5g/L、0.1-1g/L、0.1-0.9g/L、0.1-0.8g/L、0.1-0.7g/L、0.1-0.6g/L、0.1-0.5g/L、0.1-0.4g/L、0.1-0.3g/L、0.1-0.2g/L、0.2-0.4g/L、0.3-0.4g/L、0.2-0.3g/L。在一个或多个实施方案中，白蛋白是重组人白蛋白。在一个或多个实施方案中，重组人白蛋白浓度为0.1-5g/L、0.1-4.5g/L、0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.1-1.5g/L、0.1-1g/L、0.1-0.5g/L、0.25-1g/L、0.25-0.5g/L。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含1％-5％氨基酸、1％-5％维生素、无机盐、1-4g/L碳源、0.5-1.5mg/L谷胱甘肽、0.15-1.5g/L白蛋白、0.1-0.6g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含2％-4％氨基酸、2％-4％维生素、无机盐、1-3g/L碳源、1mg/L谷胱甘肽、0.25-1g/L白蛋白、0.1-0.4g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含2％氨基酸、2％维生素、无机盐、1g/L碳源、1mg/L谷胱甘肽、0.25g/L白蛋白、0.1g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包含1-20uM、2-15uM、3-12uM的GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂。优选地，GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂是CHIR-99021。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含3-12uM的CHIR-99021。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包含1-20uM、2-15uM、2.5-10uM的Wnt通路抑制剂。优选地，Wnt通路抑制剂是IWR1。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包含2.5-10uMIWR1。在一个或多个实施方案中，碳源是葡萄糖。在一个或多个实施方案中，pH调节剂是HEPES。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基的pH为6-9，优选pH为7-8，更优选pH为7.6。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包含抑菌剂，例如抗生素。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包括pH指示剂，例如酚红。在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：甘氨酸、丙氨酰、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。优选地，所述各氨基酸是L-氨基酸。在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：5-15mg/L的甘氨酸、400-500mg/L的丙氨酰、150-250mg/L的精氨酸、40-60mg/L的天冬酰胺、15-25mg/L的天冬氨酸、40-60mg/L的胱氨酸、15-25mg/L的谷氨酸、10-20mg/L的组氨酸、15-25mg/L的羟脯氨酸、40-60mg/L的异亮氨酸、40-60mg/L的亮氨酸、30-50mg/L的盐酸赖氨酸、10-20mg/L的蛋氨酸、10-20mg/L的苯基丙氨酸、15-25mg/L的脯氨酸、25-35mg/L的丝氨酸、15-25mg/L的苏氨酸、2-8mg/L的色氨酸、15-25mg/L的酪氨酸、15-25mg/L的缬氨酸。优选地，所述各氨基酸是L-氨基酸。在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：10mg/L的甘氨酸、446mg/L的L-丙氨酰、200mg/L的L-精氨酸、50mg/L的L-天冬酰胺、20mg/L的L-天冬氨酸、50mg/L的L-胱氨酸、20mg/L的L-谷氨酸、15mg/L的L-组氨酸、20mg/L的L-羟脯氨酸、50mg/L的L-异亮氨酸、50mg/L的L-亮氨酸、40mg/L的L-盐酸赖氨酸、15mg/L的L-蛋氨酸、15mg/L的L-苯基丙氨酸、20mg/L的L-脯氨酸、30mg/L的L-丝氨酸、20mg/L的L-苏氨酸、5mg/L的L-色氨酸、20mg/L的L-酪氨酸、20mg/L的L-缬氨酸。在一个或多个实施方案中，维生素包括选自以下的一种或多种或全部：维生素H、氯化胆硷、右旋泛酸钙、维生素B、烟酰胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的无血清分化培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸，或由其组成，/n优选地，所述培养基具有选自以下的一个或多个特征：/n碳源是葡萄糖；/n氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：甘氨酸、丙氨酰、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；/n维生素包括选自以下的一种或多种或全部：维生素H、氯化胆硷、右旋泛酸钙、维生素B、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素B2、盐酸硫胺素、维生素B12、肌醇；/n无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：钙盐、镁盐、钾盐、硝酸盐、硫酸盐、氯化物、磷酸盐；/n所述培养基还包含pH调节剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的无血清分化培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸，或由其组成，
优选地，所述培养基具有选自以下的一个或多个特征：
碳源是葡萄糖；
氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：甘氨酸、丙氨酰、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；
维生素包括选自以下的一种或多种或全部：维生素H、氯化胆硷、右旋泛酸钙、维生素B、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素B2、盐酸硫胺素、维生素B12、肌醇；
无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：钙盐、镁盐、钾盐、硝酸盐、硫酸盐、氯化物、磷酸盐；
所述培养基还包含pH调节剂。


2.如权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸或由其组成，
优选地，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：80-120mg/L的Ca(NO3)24H2O、80-120mg/L的MgSO47H2O、300-500mg/L的KCl、1500-2500mg/L的NaHCO3、4500-6500mg/L的NaCl、500-1100mg/L的Na2HPO4。


3.如权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，
所述培养基还包含1-20uM的GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂，优选地，GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂是CHIR-99021，或
所述培养基还包含1-20uM的Wnt通路抑制剂，优选地，Wnt通路抑制剂是IWR1。


4.一种诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的方法，包括用权利要求1-3中任一项所述的分化培养基孵育DYR0100细胞，
优选地，所述方法包括
(1)用含有1-20uM的GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂的分化培养基孵育DYR0100细胞，
(2)用含有1-20uM的Wnt通路抑制剂的分化培养基继续孵育，和
任选的(3)用不含GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂和Wnt通路抑制剂的分化培养基继续孵育，
其中，所述分化培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。


5.一种心肌细胞的无血清生长培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、抗坏血酸、转铁蛋白、亚硒酸钠、0.1-5％脂质浓缩物、0.1-5g/L胰岛素，或由其组成，
优选地，所述生长培养基具有选自以下的一个或多个特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志敏，虞修简，黄薇，
申请(专利权)人：上海产业技术研究院，上海人类基因组研究中心，
类型：发明
国别省市：上海;31