一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体为一种具有较髙棒状杆菌复制能力的表达质粒，所述表达质粒的第1786位点的核苷酸为A或G，其余位点与质粒pXMJ19相同；所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。通过在pXMJ19载体的棒状杆菌复制子调节部位，将第1786位点的核苷酸C进行人工突变，成功获得2株比pXMJ19质粒拷贝能力高6～8.5倍的棒状杆菌/大肠杆菌双用载体pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G质粒，pXMJ19C1786A拷贝数约为115，pXMJ19C1786G质粒的拷贝数约为170。

An expression plasmid with high replication ability of Corynebacterium and its construction method

【技术实现步骤摘要】
一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法。
技术介绍
好的基因工程疫苗最大的特点在于它不带任何感染性病毒，因此不会引起由病毒感染带来的毒副作用，从而更加安全可靠。此外基因工程疫苗相对于传统疫苗生产过程来说具有更加简便、质量更易控制、更便于储存与运输等优势。作为一类新兴生物技术,基因工程疫苗的应用正在不断拓展,逐渐成为经济社会中疫病防治的发展新趋势。基因工程疫苗主要有两类：一类是核酸类包括DNA和RNA疫苗，另一类是含特异性抗原蛋白的亚单位疫苗。二者均通过抗原蛋白诱导宿主细胞产生应对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。基因工程疫苗的制备虽可通过生物合成，如直接合成多肽(亚单位疫苗)或合成能在宿主细胞内表达的DNA序列(DNA疫苗)，但无论生物合成多肽还是合成核酸其造价都很高，远不能用于规模化生产，目前基因工程疫苗的制备还完全依赖于细菌或细胞这些相对便宜且易于控制的生物工厂来生产。如蛋白亚单位疫苗的生产途径主要包括制备表达质粒以及蛋白表达与纯化，抗原蛋白的制备过程包括将质粒转化进原核细胞，主要是大肠杆菌或真核细胞(针对需要三维空间或糖基化修饰的抗原蛋白)进行转录和翻译从而产生抗原蛋白作为蛋白亚单位疫苗的原材料。DNA疫苗制作过程包括把抗原基因克隆到能在真核内表达的载体拟获得表达该抗原基因的质粒，再将该质粒转化进大肠杆菌，让质粒先在细菌这个廉价工厂中大量扩增，再通过一系列步骤将质粒DNA从细菌工厂中提取出来，DNA疫苗经肌肉注射或微弹轰击等方法导入宿主体内，通过宿主细胞将疫苗携带的抗原基因表达成抗原蛋白。比之蛋白疫苗其优点是抗原蛋白在宿主体内合成，能被正确地折叠和修饰，抗原性强，由于疫苗的主要成分是DNA因此更易储存和运输。但由于进入宿主细胞的外源DNA不能在宿主细胞内复制因此能进入宿主细胞的DNA的量是除抗原自身的效价外影响疫苗效力的另一关键因素。目前无论直接用作DNA疫苗的质粒还是用于生产抗原蛋白的质粒都是带大肠杆菌复制子的质粒，这类质粒只能在大肠杆菌中复制，由于大肠杆菌是格兰式阴性菌，含有大量内毒素，通过该菌种制备质粒最严重的问题就是产生内毒素污染，因为内毒素是重要的致热源，能产生严重毒副作用，国家食品药品监管局对其有严格的要求。此外，目前用于表达抗原蛋白的宿主细胞主要也是大肠杆菌，由大肠杆菌进行大规模抗原蛋白表达常用的纯化方法也很难避免内毒素污染，为此寻找新的更好的抗原表达质粒仍然是基因工程疫苗生产的重大攻关难题之一。为了避免内毒素污染，最直接的方法就是避免使用大肠杆菌来生产质粒或表达蛋白，然而目前已商业化的质粒基本上全是只能在大肠杆菌内复制的质粒。棒状杆菌基于它不产生内毒素越来越受到科学工作者的青睐，谷氨酸棒状杆菌不仅已广泛用于微生物发酵工程生产谷氨酸(味精)，近年来人们也开始探讨，研发它在蛋白生产方面的应用，并受到越来越广泛的关注。然而有关棒状杆菌生物代谢和细菌复制的研究远不及大肠杆菌那样深入和全面，因而推广到市面上的能在棒状杆菌内复制的商业化载体非常少见，并且它们的拷贝能力属于中低范围，低的拷贝能力直接导致产量低下从而推高成本，很难用于大规模生产。申请人天津大学于2019年7月15日提出了专利技术专利申请201910636614.1，公开了一种合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌及构建方法及应用，其构建方法为：将酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W和截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶基因tVoGES通过融合PCR的方法连接，同源区加入核糖体结合位点序列，插入谷氨酸棒状杆菌表达质粒pEC-XK99E的SacI和XbaI酶切位点得到质粒1；将质粒1转化进入谷氨酸棒状杆菌，得到合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1；该专利技术为香叶醇的合成提供更多的前体，发酵时间短42-48小时，经气质检测，未检测出相应的副产物。申请人天津科技大学于2018年4月20日提出了专利技术专利申请201810356892.7，公开了一种棒状杆菌诱导型启动子及含有该启动子的表达载体与应用，所述表达载体转化至谷氨酸棒状杆菌获得的5-氨基乙酰丙酸生产菌株并利用该菌株发酵法生产5-氨基乙酰丙酸。用该专利技术获得的启动子构建的表达载体，通过肌醇诱导实现基因的可控表达，克服了现用诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)对菌体细胞生长的抑制作用以及因其价格高昂造成的生产成本高等不足，同时具有稳定性等特性。利用该启动子整合于宿主基因组或将表达载体转化至宿主谷氨酸棒状杆菌构建获得5-氨基乙酰丙酸生产菌株，其5-氨基乙酰丙酸产量达到24.2g/L。以上两个专利技术专利申请都是通过对质粒pXMJ19进行酶切并插入目的基因得到重组质粒，并将重组质粒导入至谷氨酸棒状杆菌，分别用于生产香叶醇和5-氨基乙酰丙酸，其都是上述
技术介绍
中提到的微生物发酵工程领域的应用，并未涉及到本专利技术提到的用于直接合成多肽(亚单位疫苗)或合成能在宿主细胞内表达的DNA序列(DNA疫苗)领域的应用。pXMJ19在棒状杆菌的复制能力仅约20拷贝。本专利技术要解决的技术问题是：如何构建一种具高拷贝复制能力的棒状杆菌复制载体。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种具有较髙棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法，通过在pXMJ19载体的棒状杆菌复制子调节部位，将第1786位点的核苷酸C进行人工突变，成功获得2株比pXMJ19质粒拷贝能力高6～8.5倍的棒状杆菌/大肠杆菌双用载体pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G质粒，pXMJ19C1786A拷贝数约为115，pXMJ19C1786G质粒的拷贝数约为170。本专利技术的技术方案为：一种表达质粒，所述表达质粒的第1786位点的核苷酸为A或G，其余位点与质粒pXMJ19相同；所述表达质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:13或SEQIDNO:14所示。pXMJ19-C1786A序列表(SEQIDNO:13)attcggggtcgttcactggttcccctttctgatttctggcatagaagaacccccgtgaactgtgtggttccgggggttgctgatttttgcgagacttctcgcgcaattccctagcttaggtgaaaacaccatgaaacactagggaaacacccatgaaacacccattagggcagtagggcggcttcttcgtctagggcttgcatttgggcggtgatctggtctttagcgtgtgaaagtgtgtcgtaggtggcgtgctcaatgcactcgaacgtcacgtcatttaccgggtcacggtgggcaaagagaactagtgggttagacattgttttcctcgttgtcggtggtggtgagcttttctagccgctcggtaaacgcggcgatcatgaactcttggaggttt本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达质粒，其特征在于，所述表达质粒的第1786位点的核苷酸为A或G，其余位点与质粒pXMJ19相同；/n所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达质粒，其特征在于，所述表达质粒的第1786位点的核苷酸为A或G，其余位点与质粒pXMJ19相同；
所述表达质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:13或SEQIDNO:14所示。


2.一种如权利要求1所述的表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：以质粒pXMJ19为模板，分别设计引物通过PCR扩增将质粒pXMJ19第1786位点的核苷酸C突变为A的长度为2282bp的DNA片段1和长度为4351bp的DNA片段2；所述引物为C1786A-F、C1786A-R、V-C1786A-F、V-C1786A-R且其核苷酸序列依次如SEQIDNO:1～SEQIDNO:4所示；所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQIDNO:15所示，所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQIDNO:16所示；
步骤2：将步骤1得到的DNA片段1和DNA片段2进行同源重组，得到如序列表SEQIDNO:13所述的表达质粒pXMJ19C1786A。


3.根据权利要求2所述的表达质粒的构建方法，其特征在于，所述步骤1中：
DNA片段1、DNA片段2的PCR扩增方法为：
DNA聚合酶1uL，dNTPMixture1uL，其中dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度均为2.5mM，引物C1786A-R为10pmoL，引物C1786A-F为10pmoL，模板pXMJ19为30ng，缓冲液25uL，加无核酸酶灭菌水至50uL；PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共30个循环，72℃保温5min；
DNA聚合酶1uL，dNTPMixture1uL，其中dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度均为2.5mM，引物V-C1786A-F为10pmoL，引物V-C1786A-R为10pmoL，模板pXMJ19为30ng，缓冲液25uL，加无核酸酶灭菌水至50uL；PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共30个循环，72℃保温5min。


4.根据权利要求2所述的表达质粒的构建方法，其特征在于，所述步骤2中，同源重组的体系为：DNA片段1加入量为DNA片段1的碱基数×0.02ng；DNA片段2加...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞爱，闫圆圆，刘定祥，黄梅，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44