一种猪子宫内膜来源的外泌体及其提取方法与应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种猪子宫内膜来源的外泌体及其提取方法与应用。本发明专利技术先分离得到子宫内膜组织，然后剪碎成组织块；冲洗后在20～30℃，80～100g条件下离心3～10min，弃上清液；再将组织块置于Hanks’Balanced Salt Solution中孵育，收集猪子宫内膜培养液；最后采用超速离心法提取外泌体，得到猪子宫内膜来源的外泌体。与现有技术相比，本发明专利技术提供的方法更加简单便捷，节约了样品收集的成本，减少了人力的损耗，同时也节约了采样的时间，增加了采样的效率。提取的外泌体在电镜下外泌体形状更加明显，背景干净且无杂质，可以作为促进猪胚胎体外培养效率的添加剂。

Exosomes from porcine endometrium and its extraction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种猪子宫内膜来源的外泌体及其提取方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种猪子宫内膜来源的外泌体及其提取方法与应用。
技术介绍
子宫内膜是一个复杂的动态组织，在女性的整个生殖生活中都会经历周期性的重塑和分化。成功的受孕需要优质的胚胎与容受性良好的子宫内膜共同作用,胚胎能否成功植入子宫内膜决定了妊娠的结果。在胚胎植入过程中，子宫内膜上皮与囊胚，特别是滋养细胞之间的串扰是成功植入的前提条件。在这种串扰期间，发生各种分子和功能变化，以促进胚胎与子宫内膜以及子宫腔微环境之间的同步性。特别地，对滋养外胚层进行调制，以实现子宫内膜的附着。因此，滋养外胚层和子宫内膜上皮之间的细胞间通讯对于胚胎着床和怀孕的建立至关重要。外泌体是一类直径为30～150nm的双层膜囊泡，能携带蛋白质、miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA等物质，能选择性的与靶细胞融合，把所携带的遗传物质运输到靶细胞中发挥功能，远程行使细胞间信号传递的作用被认为是一种新型的细胞间信号交流方式。研究表明，外泌体中含有的一些蛋白质有助于外泌体刺激免疫细胞消灭病变细胞(吴金恩,丁军涛.外泌体生物学功能及应用研究进展.动物医学进展.2016；37(12):90-4.)；外泌体可以将RNAs从分泌细胞携带到靶细胞，并在靶细胞内发挥作用，当RNAs通过外泌体到达受体细胞之后，mRNA可以转化为功能性蛋白质；miRNA能够使mRNA发生降解，或者mRNA的翻译过程得到抑制，从而使得蛋白质的表达得到调控(葛卉.发情期牛子宫液外泌体的提取与鉴定及其对体外受精胚胎发育的影响[硕士]:西北农林科技大学；2017.)；Thakur(ThakurBK,ZhangH,BeckerA,MateiI,HuangY,Costa-SilvaB,etal.Double-strandedDNAinexosomes:anovelbiomarkerincancerdetection.Cellresearch.2014；24(6):766-9.)等人在研究胰腺癌来源的外泌体时还发现其中含有稳定的双链DNA结构，并表示其可能成为潜在的癌症诊断的生物标志物。Testa等人(TestaJS,ApcherGS,ComberJD,EisenlohrLC.Exosome-drivenantigentransferforMHCclassIIpresentationfacilitatedbythereceptorbindingactivityofinfluenzahemagglutinin.Journalofimmunology(Baltimore,Md:1950).2010；185(11):6608-16.)的研究表明外泌体能够携带一些具有功能性的抗原肽复合物来介导抗病毒免疫，进而降低了宿主对感染的易感性。经过基因修饰表达IL-4的树突状细胞的外泌体，通过动物实验，发现胶原诱导性关节炎小鼠的临床症状有所减轻，而且其体内的迟发型超敏反应也得到了抑制(KimSH,BiancoNR,ShufeskyWJ,MorelliAE,RobbinsPD.EffectivetreatmentofinflammatorydiseasemodelswithexosomesderivedfromdendriticcellsgeneticallymodifiedtoexpressIL-4.Journalofimmunology(Baltimore,Md:1950).2007；179(4):2242-9.)。研究发现子宫液/粘液和子宫内膜上皮细胞的制剂中存在外泌体。妊娠子宫中不仅包含了来源于母体的外泌体，同时也包含了来源于胚胎的外泌体，在母胎交流中，来源于母体的外泌体和来源于胚胎的外泌体携带的物质相互交换，外泌体在整个妊娠过程中会在时间和空间上有序表达。因此，在胚胎附植过程中，母体子宫腔液外泌体能在子宫内膜细胞与胚胎细胞间相互传递信息(包括RNAs、蛋白质和脂质分子)，从而发挥母胎对话的功能，对胚胎附植成功率具有重要影响。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种猪子宫内膜来源的外泌体的提取方法。本专利技术的另一目的在于提供上述提取方法提取得到的猪子宫内膜来源的外泌体。本专利技术的再一目的在于提供上述猪子宫内膜来源的外泌体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种猪子宫内膜来源的外泌体的提取方法，包含如下步骤：(1)猪屠宰后取出子宫，在待取子宫角的两侧系紧，以确保子宫腔密闭，清洗后沿纵轴切开子宫角，暴露子宫腔；将子宫内膜组织从子宫肌层上分离，并将子宫内膜组织剪碎成组织块；(2)用含1％(v/v)antibiotic-antimycotic、0.002mg/ml两性霉素B和0.05mg/ml庆大霉素的无菌DPBS冲洗步骤(1)中剪碎后的组织块以去除杂质，然后在20～30℃，80～100g条件下离心3～10min，弃上清液；(3)将步骤(2)中离心弃上清液后的组织块置于Hanks’BalancedSaltSolution中，在37℃，5％CO2的条件下孵育20～28h，收集猪子宫内膜培养液；(4)将步骤(3)收集的猪子宫内膜培养液采用超速离心法提取外泌体，得到猪子宫内膜来源的外泌体；步骤(1)中所述的组织块的大小优选为1～5mm3大小；步骤(1)中所述的清洗的具体操作优选为：先用体积分数为75％的酒精清洗2～3次，再用含1％(v/v)antibiotic-antimycotic、0.002mg/ml两性霉素B和0.05mg/ml庆大霉素的生理盐水冲洗2～3次，最后用含1％(v/v)antibiotic-antimycotic、0.002mg/ml两性霉素B和0.05mg/ml庆大霉素的无菌DPBS冲洗1～2次；通过上述清洗，达到灭菌消毒和清洗子宫、去除杂质以及防止污染的目的；步骤(2)中所述的离心的条件优选为25℃，90g条件下离心5min；步骤(3)中所述的孵育时间优选为24h；步骤(4)中所述的超速离心法的具体操作优选为：①将收集的子宫内膜培养液在4℃，2000g的离心条件下离心20min，收集上清液；②将步骤①收集的上清液在4℃，10000g的离心条件下离心30min，收集上清液；③将步骤②收集的上清液在4℃，120000g的离心条件下离心2h，弃上清液，收集沉淀；④将步骤③收集的沉淀用DPBS重悬，再次在4℃，120000g的离心条件下离心2h，弃上清液，所得到的沉淀即为子宫内膜来源的总外泌体；一种猪子宫内膜来源的外泌体，通过上述提取方法提取得到；所述的猪子宫内膜来源的外泌体在制备胚胎体外培养添加剂中的应用；所述的胚胎体外培养添加剂优选为促进胚胎滋养层细胞增殖产品；所述的应用，优选包含如下步骤：将胚胎滋养层细胞接种到含有上述猪子宫内膜来源的外泌体的培养基中培养24～48h；所述的培养基中猪子宫内膜来源的外泌体浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪子宫内膜来源的外泌体的提取方法，其特征在于包含如下步骤：/n(1)猪屠宰后取出子宫，在待取子宫角的两侧系紧，以确保子宫腔密闭，清洗后沿纵轴切开子宫角，暴露子宫腔；将子宫内膜组织从子宫肌层上分离，并将子宫内膜组织剪碎成组织块；/n(2)用含1％(v/v)antibiotic-antimycotic、0.002mg/ml两性霉素B和0.05mg/ml庆大霉素的无菌DPBS冲洗步骤(1)中剪碎后的组织块以去除杂质，然后在20～30℃，80～100g条件下离心3～10min，弃上清液；/n(3)将步骤(2)中离心弃上清液后的组织块置于Hanks’Balanced Salt Solution中，在37℃，5％CO

【技术特征摘要】
1.一种猪子宫内膜来源的外泌体的提取方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)猪屠宰后取出子宫，在待取子宫角的两侧系紧，以确保子宫腔密闭，清洗后沿纵轴切开子宫角，暴露子宫腔；将子宫内膜组织从子宫肌层上分离，并将子宫内膜组织剪碎成组织块；
(2)用含1％(v/v)antibiotic-antimycotic、0.002mg/ml两性霉素B和0.05mg/ml庆大霉素的无菌DPBS冲洗步骤(1)中剪碎后的组织块以去除杂质，然后在20～30℃，80～100g条件下离心3～10min，弃上清液；
(3)将步骤(2)中离心弃上清液后的组织块置于Hanks’BalancedSaltSolution中，在37℃，5％CO2的条件下孵育20～28h，收集猪子宫内膜培养液；
(4)将步骤(3)收集的猪子宫内膜培养液采用超速离心法提取外泌体，得到猪子宫内膜来源的外泌体。


2.根据权利要求1所述的猪子宫内膜来源的外泌体的提取方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的组织块的大小为1～5mm3大小。


3.根据权利要求1所述的猪子宫内膜来源的外泌体的提取方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的清洗的具体操作为：
先用体积分数为75％的酒精清洗2～3次，再用含1％(v/v)antibiotic-antimycotic、0.002mg/ml两性霉素B和0.05mg/ml庆大霉素的生理盐水冲洗2～3次，最后用含1％(v/v)antibiotic-antimycotic、0.002mg/ml两性霉素B和0.05mg/ml庆大霉素的无菌DPBS冲洗1～2次。


4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴珍芳，洪林君，蔡更元，胡群，刘德武，李紫聪，顾婷，杨杰，杨化强，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44