用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于荧光适体传感器领域，特别是指用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用。本申请基于核酸适体功能化的纳米金和荧光检测技术灵敏度高的优点，将40nm的金作为淬灭基团与探针Ⅰ的5端通过Au‑S连接起来，FAM做为荧光基团标记在探针Ⅱ的3端，构建了一种用于检测银离子浓度的荧光适体传感器，并对水环境中不同浓度的银离子进行检测，从而验证该传感器的检测性能。实验结果表明，该传感器检测的线性范围在10‑60nmol/L，检出限为10nmol/L。

Fluorescent aptamer sensor for the detection of silver ion concentration and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用
本专利技术属于荧光适体传感器领域，特别是指用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
银凭借其独特的性能，在医疗材料、摄影、电子、成像等行业中应用广泛。然而，银离子被列为最具毒性的重金属离子之一。当银离子随工业废水排入土壤和水源后，就会被动植物吸收，接着又随食物链进入人体与人体内的蛋白质、酶发生相互作用，严重威胁人类的健康。因此，检测水环境中银离子浓度对保护人类生命健康至关重要。目前检测银离子浓度的方法主要依赖于电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法和电感耦合等离子体/原子发射光谱法。尽管这些方法检测精度比较高，但仪器耗资昂贵、运行费用高、操作要求多，检测比较费时、费力，而且测量时需萃取、浓缩富集或抑制干扰等复杂前处理过程。而生物传感器，凭借其具有选择性高、分析速度快和仪器价格低廉等特点，引起研究者的极大关注，目前研究工作大都致力于研制荧光、比色或电化学传感器。其中，荧光分析技术具有灵敏度高、精度高、检测速度快等优点在各种分子检测中应用广泛。Long利用NaYF4:Yb3+、Tm3+上转换纳米颗粒（UCNPS）设计了一种定量检测银离子的荧光传感器，检出限为33nmol/L。YanLu等人基于Ag+与谷胱甘酸（GSH）的相互作用，研究了检测银离子的金属配位聚合物荧光传感器，检出限为50nmol/L。以上检测银离子的方法中荧光传感器主要利用化学的方法来捕获重金属离子，检出限难以达到测量需求。一些研究者为了提高传感器的灵敏性，利用核酸适体和银离子的相互作用来检测银离子。HuaLv等人提出了以两个离子作为输入而荧光作为输出的可逆氧化石墨烯抑制逻辑门来检测Ag+和I-。该传感器的检出限达到10nM，虽然具有较高的灵敏度和较低的背景干扰，但引入了有毒物质AgI。YuFengZhu等人利用银离子能使核酸适体从随机线圈结构变成G-四重结构来检测银离子，检出为0.64nM。虽然具有较高的灵敏性，但引入了有毒溶剂EDTA，会对水环境产生额外的影响。KangMao等人使用单层的MoS2作为荧光淬灭剂，并结合银离子与核酸适体中不匹配碱基C的相互作用来检测银离子，检出限为1nmol/L。虽然具有良好的灵敏性，但是MoS2的制备过程繁琐，并引入了EDTA有毒溶剂。可见利用核酸适体构建的荧光传感器灵敏度有所提高，但是现有相关研究中多数引进了有毒物质，不利于推广应用。本申请基于核酸适体功能化的纳米金和荧光检测技术灵敏度高的优点，将40nm的金作为淬灭基团与探针Ⅰ的5端通过Au-S连接起来，FAM做为荧光基团标记在探针Ⅱ的3端，构建了一种用于检测银离子浓度的荧光适体传感器，具有操作简单、灵敏和不引入有毒溶剂等优点。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提出一种用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用，利用银离子能与核酸适体中不匹配的C碱基形成C-Ag+-C的复合结构，以及在银离子存在时FAM标记的DNA和纳米金修饰的DNA能发生互补配对从而拉近纳米金和FAM之间的距离，发生荧光能量共振转移的现象的原理。本专利技术的技术方案是这样实现的：用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，步骤如下：（1）将探针Ⅰ和探针Ⅱ分别加入TCEP溶液中活化2h，得核酸适体溶液和HDNA-FAM溶液；（2）将纳米金溶液与步骤（1）的核酸适体溶液混合并振荡培养12h，得混合液；（3）向步骤（2）的混合液中加入NaCl溶液，振荡培养24h后，离心、去除上清液并将沉淀分散于Tris-CH3COOH缓冲液中，最后加入步骤（1）的HDNA-FAM溶液，即得荧光适体传感器溶液。所述步骤（1）中探针Ⅰ的DNA序列为5’-SH-CTACCCTAGC-3’；探针Ⅱ的DNA序列为5’-GCTACCCTAG-FAM-3’。所述核酸适体溶液中探针Ⅰ的终浓度为5μM、HDNA-FAM溶液中探针Ⅱ的终浓度为5μM。所述TCEP溶液的浓度为100mM，TCEP溶液中含有20mMTris-CH3COOH。所述步骤（2）中纳米金溶液的浓度为12.5μg/mL，纳米金溶液与步骤（1）的核酸适体溶液的体积比为（1-8）：1。所述步骤（3）中NaCl溶液的浓度为2mol/L，Tris-CH3COOH缓冲液的浓度为10mmol/L、pH为7，Tris-CH3COOH缓冲液的体积不小于600μL。加入NaCl溶液的具体操作为：每隔3h加一次，最终使NaCl的浓度达到0.1-0.4mol/L；离心的条件为14000rpm离心20min。所述荧光适体传感器溶液中探针Ⅰ和探针II的物质的量比为1：1。上述方法所制备的荧光适体传感器，所述荧光适体传感器基于荧光共振能量转移原理，将DNA功能化的纳米金作为能量受体，修饰在核酸适体上的FAM作为能量供体。所述的荧光适体传感器在灵敏、特异性的检测水环境中的银离子浓度的应用，检测步骤为：向荧光适体传感器溶液中加入100μL待测样本，于30℃孵化40min，取出600μL放入荧光光谱仪，检测荧光强度值，代入线性回归方程y=-0.87419x+235.5907，R2=0.994997，即可得出待测样本中银离子浓度。本专利技术具有以下有益效果：1、本申请构建了一种用于检测水环境中银离子浓度的荧光适体传感器，纳米金和修饰有巯基的核酸适体通过Au-S连接在一起，当不存在银离子时，尽管两条DNA链有7个碱基互补配对，但3个碱基对之间的氢键力被强静电斥力抵消，所以两条DNA序列不能杂交；当存在银离子时，两条DNA链会通过C-Ag+-C进行特异性结合，拉近了FAM与纳米金之间的距离引起荧光淬灭，淬灭的程度与银离子的浓度有关。2、本专利技术为了提高传感器的灵敏度，优化了荧光适体传感器的各项制备参数，并在纳米金与核酸适体的体积比为5：1，NaCl的浓度为260mmol/L，溶液呈中性，且培养的温度在30℃的参数下检测不同浓度的银离子。实验结果表明，该传感器检测的线性范围在10-60nmol/L，检出限为10nmol/L。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为检测银离子浓度的原理图。图2为传感器的响应特性。图3为AuNPs和aptamer不同体积时的光谱图和折线图。图4为不同NaCl浓度下的光谱图和折线图。图5为不同温度下的荧光光谱图和折线图。图6为不同pH下的荧光光谱图和折线图。图7为银离子浓度在10-60nmol/L时溶液的荧光光谱和折线图。图8为传感器的特异性检测柱状图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于步骤如下：/n（1）将探针Ⅰ和探针Ⅱ分别加入TCEP溶液中活化2h，得核酸适体溶液和HDNA-FAM溶液；/n（2）将纳米金溶液与步骤（1）的核酸适体溶液混合并振荡培养12h，得混合液；/n（3）向步骤（2）的混合液中加入NaCl溶液，振荡培养24h后，离心、去除上清液并将沉淀分散于Tris-CH

【技术特征摘要】
1.用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）将探针Ⅰ和探针Ⅱ分别加入TCEP溶液中活化2h，得核酸适体溶液和HDNA-FAM溶液；
（2）将纳米金溶液与步骤（1）的核酸适体溶液混合并振荡培养12h，得混合液；
（3）向步骤（2）的混合液中加入NaCl溶液，振荡培养24h后，离心、去除上清液并将沉淀分散于Tris-CH3COOH缓冲液中，最后加入步骤（1）的HDNA-FAM溶液，即得荧光适体传感器溶液。


2.根据权利要求1所述的用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中探针Ⅰ的DNA序列为5’-SH-CTACCCTAGC-3’；探针Ⅱ的DNA序列为5’-GCTACCCTAG-FAM-3’。


3.根据权利要求2所述的用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述核酸适体溶液中探针Ⅰ的终浓度为5μM、HDNA-FAM溶液中探针Ⅱ的终浓度为5μM。


4.根据权利要求3所述的用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述TCEP溶液的浓度为100mM，TCEP溶液中含有20mMTris-CH3COOH。


5.根据权利要求1所述的用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中纳米金溶液的浓度为12.5μg/mL，纳米金溶液与步骤（1）的核酸适体溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：任林娇，姜利英，秦自瑞，张培，王慰，张吉涛，王延峰，姜素霞，
申请(专利权)人：郑州轻工业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41