本发明专利技术公开了一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，该分析方法步骤如下：首先对将细菌样品进行淬灭，分别设置了设置大肠杆菌/载入A型肉毒毒素基因的大肠杆菌组、A型肉毒杆菌/B型肉毒杆菌的肉毒杆菌组；对淬灭后的细菌样品进行代谢物的提取；未衍生化的提取物进行液质联用质谱(LC‑TOF/MS)检测，原始数据使用使用仪器自带软件对原始数据进行处理后，使用MetaboAnalyst软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘‑判别分析(PLS‑DA)，得到具有显著差异的代谢物；将衍生化后的提取物进行气质联用质谱(GC‑TOF/MS)检测，使用仪器自带软件对原始数据进行处理后，使用Simca13.0软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘‑判别分析(PLS‑DA)，得到具有显著差异的代谢物。本发明专利技术无需复杂的样品处理过程、灵敏度高、准确度高的特点，可作为一种有效的方法用于判断受污染食品中肉毒杆菌的具体血清型。
A method for serotyping of Botox based on mass spectrometry
【技术实现步骤摘要】
一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法
本专利技术涉及非靶向代谢组学分析、质谱相对定量分析领域，具体涉及一种基于质谱检测的一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法。
技术介绍
不同血清型的肉毒杆菌在基因组上十分相似，仅在毒力因子上有所不同，因此在血清型分析上十分困难。对污染食品的肉毒杆菌进行分型的方法，主要是依据基因测序和免疫学实验等生物学方法，这些生物学方法实验过程复杂，且容易受到实验中各种因素的干扰影响检测结果的准确性。代谢组学技术通过核磁共振、液质联用、气质联用等技术，能够对生物体的代谢物进行采集分析，从而观测生物体代谢水平整体的动态变化。目前，代谢组学技术应用广泛，对样品进行简单处理后，使用到的液质联用技术对极性、不易挥发的物质进行分析，气质联用技术对非极性、热稳定的物质进行分析，两种方法结合起来对生物体的代谢物进行完整的分析。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服传统的对细菌分型的生物学方法，其对实验过程复杂，且容易受到实验中各种因素的干扰，无法进行准确的判断等问题，提供一种有效的方法，能够作为对污染食品的肉毒杆菌进行分型的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：对肉毒杆菌提取物进行质谱检测，通过代谢组学分析得到差异代谢物，从而对不同细菌血清型分型的方法。一种基于质谱检测的对细菌不同血清型分型的方法包括以下步骤：1)设置大肠杆菌/载入A型肉毒毒素基因的大肠杆菌组、A型肉毒杆菌/B型肉毒杆菌的肉毒杆菌组，将细菌样品进行淬灭；2)对步骤1)淬灭后的样品进行提取；3)用步骤2)得到的样品进行液质联用质谱(LC-TOF/MS)检测，原始数据使用使用仪器自带软件对原始数据进行处理后，使用MetaboAnalyst软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，得到具有显著差异的代谢物；4)用步骤2)得到的样品进行衍生化；5)将步骤4)得到的样品进行气质联用质谱(GC-TOF/MS)检测，使用仪器自带软件对原始数据进行处理后，使用Simca13.0软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，得到具有显著差异的代谢物；步骤(1)所述淬灭实验：将液体培养基中的细菌样品与经-80℃预冷的60％甲醇-水溶液等体积混匀，随后在-9℃，3000g条件下离心9min，快速弃去上清。步骤(2)所述提取实验：将淬灭得到的沉淀重悬于500μL经-80℃预冷的100％甲醇(LC-MS检测的样品使用90％甲醇-水溶液)中，在液氮中冷冻，干冰中融解，重复三次冻融，随后在-9℃，16000g条件下离心5min，上清存储于干冰内。在沉淀中再次加入500μL经-80℃预冷的100％甲醇(LC-MS检测的样品使用90％甲醇-水溶液)，重复上面的步骤，将两次的上清收集到一起。步骤(3)所述LC-TOF/MS条件为：流动相：0.1％甲酸-水溶液、0.1％甲酸乙腈溶液；色谱柱：C18分析柱(2.1×100mm，1.8μm)；离子源：ESI源，3kV；锥孔电压：100V；电离源温度：120℃；质量扫描范围：100-1500Da；扫描时间：0.1s。步骤(4)所述衍生化：将步骤(2)得到的提取物进行氮气吹干，干燥后的提取物与40μL20mg/mL盐酸甲氧胺吡啶溶液，涡旋，充分混匀，在30℃下，以130rpm转速孵育90min；充分反应后，再加入40μLMSTFA(含1％TMCS)，充分混匀后，在37℃下气浴30min，取出后，在室温下放置120min，终体积为80μL。步骤(5)所述GC-TOF/MS条件为：离子源：EI源，70eV；溶剂延迟：330s；质量扫描范围：50-800Da；采集电压：1550V；采集速度：10Spectra/s；进样口、传输线和离子源温度分别为：250℃、250℃及220℃。根据本专利技术的具体实施方式，优选地，上述质谱仪器均为高分辨质谱仪。本专利技术还提供上述基于质谱检测的对细菌不同血清型分型方法的应用。基于质谱检测的对细菌不同血清型分型方法在肉毒杆菌血清型分型的应用为：大肠杆菌/载入A型肉毒毒素基因的大肠杆菌组，经数据分析后发现在载入表达A型肉毒毒素的基因后，大肠杆菌组的显著差异物参与三羧酸循环的苹果酸和参与糖酵解的葡萄糖含量均下降，说明分泌肉毒毒素的过程中大肠杆菌消耗了能量；A型肉毒杆菌/B型肉毒杆菌的肉毒杆菌组，经数据分析后共发现12种差异代谢物，多为氨基酸类物质。本专利技术的优点及有益效果为：本专利技术所述质谱检测对细菌进行分型的方法具有样品处理简单、灵敏度高、准确度高的特点，可作为一种有效的方法用于判断受污染食品中肉毒杆菌的具体血清型。附图/表说明图1为基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法应用于大肠杆菌GC-MS的偏最小二乘判别分析图。图2为基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法应用于大肠杆菌LC-MS的偏最小二乘判别分析图。图3为基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法应用于大肠杆菌分析得到的显著差异代谢物。图4为基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法应用于肉毒杆菌GC-MS的偏最小二乘判别分析图。图5为基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法应用于肉毒杆菌LC-MS的偏最小二乘判别分析图。图6为基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法应用于肉毒杆菌分析得到的显著差异代谢物。具体实施方式以下实施将结合附图对本专利技术做进一步说明。实施例1一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法分为以下五步：第一步，对细菌样品进行淬灭。第二步，对淬灭后的样品进行代谢物的提取。第三步，使用液质联用质谱(LC-MS/MS)检测提取物，对数据进行PCA、PLS-DA分析，获得显著差异代谢物。第四步，对提取物进行衍生化。第五步，对衍生化后的提取物进行气质联用质谱(GC-MS)检测，对数据进行PCA、PLS-DA分析，获得显著差异代谢物。实施例2基于质谱检测的对肉毒杆菌分型的方法用于对不同大肠杆菌、不同血清型肉毒杆菌进行分型：图1至图6是实施例2的实验结果。其中图1至图3是大肠杆菌组的实验结果。在图1和图2中，每个点代表一个样本，其中图1蓝色的点以及图2红色三角形为空载大肠杆菌组，图1绿色的点以及图2绿色加号为载入肉毒毒素A基因的大肠杆菌组。根据图1和图2的实验结果图显示，两组大肠杆菌在LC-MS和GC-MS的分析中，均有明显分离的趋势转，通过对差异代谢物进行最终搜库得到图3大肠杆菌组的两种显著差异代谢物，结果表明，在载入表达A型肉毒毒素的基因后，大肠杆菌组的显著差异物参与三羧酸循环的苹果酸和参与糖酵解的葡萄糖含量均下降，说明分泌肉毒毒素的过程中大肠杆菌消耗了能量。图4至图6是肉毒杆菌组的实验结果。在图4和图5中，每个点代表一个样本，其中图4蓝色的点以及图5绿色加号为A型肉毒杆菌组，图4绿色的点以及图5红本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，其特征在于：/n具体包括如下步骤：/n1)设置大肠杆菌/载入A型肉毒毒素基因的大肠杆菌组、A型肉毒杆菌/B型肉毒杆菌的肉毒杆菌组，将细菌样品进行淬灭；/n2)对步骤1)淬灭后的样品进行提取；/n3)用步骤2)得到的样品进行液质联用质谱(LC-TOF/MS)检测，对原始数据进行处理后，使用MetaboAnalyst软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，得到具有显著差异的代谢物；/n4)将步骤2)得到的样品进行衍生化，然后进行气质联用质谱(GC-TOF/MS)检测，对原始数据进行处理后，使用Simca13.0软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，得到具有显著差异的代谢物。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，其特征在于：
具体包括如下步骤：
1)设置大肠杆菌/载入A型肉毒毒素基因的大肠杆菌组、A型肉毒杆菌/B型肉毒杆菌的肉毒杆菌组，将细菌样品进行淬灭；
2)对步骤1)淬灭后的样品进行提取；
3)用步骤2)得到的样品进行液质联用质谱(LC-TOF/MS)检测，对原始数据进行处理后，使用MetaboAnalyst软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，得到具有显著差异的代谢物；
4)将步骤2)得到的样品进行衍生化，然后进行气质联用质谱(GC-TOF/MS)检测，对原始数据进行处理后，使用Simca13.0软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，得到具有显著差异的代谢物。
2.根据权利要求1所述的基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，其特征在于：步骤(1)所述淬灭实验：将液体培养基中的细菌样品与经-80℃预冷的60％甲醇-水溶液等体积混匀，随后在-9℃，3000g条件下离心9min，快速弃去上清。
3.根据权利要求1所述的基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，其特征在于：步骤(2)所述提取实验：将淬灭得到的沉淀重悬于500μL经-80℃预冷的100％甲醇(LC-MS检测的样品使用90％甲醇-水溶液)中，在液氮中冷冻，干冰中融解，重复三次冻融，随后在-9℃，16000g条件下离心5min，上清存储于干冰内。在沉淀中再次加入500μL经-80℃预冷的100％甲醇(LC-MS检测的样品使用90％甲醇-水溶液)，重...
【专利技术属性】
技术研发人员：何昆，李梅，毛劼，刘峰，程建华，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。