【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于靶向基因组编辑的系统和方法交叉引用部分本专利申请要求于2017年10月17日提交的美国临时专利申请号62/573,402以及2017年7月28日提交的美国临时专利申请号62/538,213的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。以电子方式提交的序列表的引用所述序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“7452WOPCT_Sequence_Listing_ST25”，创建于2018年7月25日，且具有33千字节大小，并与本说明书同时提交。包括在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
技术介绍
基因组编辑技术的最新发展已使特定序列位置的序列修饰成为可能。例如，采用CRISPR-Cas系统的序列编辑使用与靶向DNA序列互补的RNA来引导Cas蛋白到达特定的序列位点进行修饰，其中位点是序列或序列内的区域，所述序列是天然的或修饰的或人工核酸分子或其表示。编辑实验可以包括位点特异性核酸酶，例如CRISPR-Cas9、TALEN、大范围核酸酶、靶向或栓系核酸酶、可编程的核酸酶、核糖核蛋白(RNP)，并且可以涉及直接转化、生物弹道递送(biolisticdelivery)、共培养，或为了实现特异性的、定向的核酸修饰或编辑的多种递送方法。此类基因组编辑可用于递送赋予所希望表型的基因组修饰，例如改善作物物种的农艺性状。
技术实现思路
特定的变种、近交种或种质可以使用任何方法的组合直接进行编辑，以将基因组编辑成分传递给植物或植...
【技术保护点】
1.一种设计使产生脱靶位点基因编辑的可能性最小化的指导多核苷酸的方法，所述方法包括：/na)将核酸内切酶的靶位点序列与来自群体中个体的未组装的原始核苷酸序列读段进行比较；/nb)将与所述靶位点序列的部分或全部对齐的原始核苷酸序列读段组装成个体重叠群；/nc)在来自步骤b的重叠群中选择包含单个拷贝的靶序列的靶位点序列；/nd)设计针对该靶位点序列的指导RNA；和/ne)使用核酸内切酶复合物中的设计的指导多核苷酸，在核酸的所述靶位点处产生预期基因编辑。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170728 US 62/538213;20171017 US 62/5734021.一种设计使产生脱靶位点基因编辑的可能性最小化的指导多核苷酸的方法，所述方法包括：
a)将核酸内切酶的靶位点序列与来自群体中个体的未组装的原始核苷酸序列读段进行比较；
b)将与所述靶位点序列的部分或全部对齐的原始核苷酸序列读段组装成个体重叠群；
c)在来自步骤b的重叠群中选择包含单个拷贝的靶序列的靶位点序列；
d)设计针对该靶位点序列的指导RNA；和
e)使用核酸内切酶复合物中的设计的指导多核苷酸，在核酸的所述靶位点处产生预期基因编辑。
2.如权利要求1所述的方法，其中原始读段核苷酸序列是短或长读段核苷酸序列读段。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述比较包括将所述靶序列与来自未组装的原始核苷酸序列读段的序列进行比对。
4.如权利要求1所述的方法，其进一步包括鉴定所述重叠群是否包含与靶位点序列具有小于100％序列同一性的靶位点序列的两个或更多个拷贝或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其进一步包括当鉴定出所述靶位点序列的多于一个拷贝时，确定经鉴定的靶位点序列的一个或多个拷贝是否来自相同来源。
6.如权利要求5所述的方法，通过使用重叠群组装程序，确定所述拷贝是否来自相同来源。
7.如权利要求1所述的方法，其中比较步骤在没有参考序列的情况下进行。
8.如权利要求1所述的方法，其中针对来自单倍型共有序列的靶位点序列设计所述指导多核苷酸。
9.如权利要求1所述的方法，其中针对由权利要求1、2或11产生的来自单倍型共有序列的靶位点序列设计所述指导多核苷酸。
10.如权利要求1所述的方法，其中使用Cas核酸内切酶复合物中的设计的指导多核苷酸，在核酸的所述靶位点处产生预期基因编辑。
11.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
对包含所述预期基因编辑的植物、哺乳动物、病毒、昆虫、真菌或微生物的表型进行评估。
12.如权利要求11所述的方法，所述方法进一步包括：在多种条件和环境下，对包含所述预期靶位点编辑的植物、哺乳动物、病毒、昆虫、真菌或微生物的表型进行评估。
13.如权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括：在测定、温室或田间的多种条件和环境下，对包含所述预期基因编辑的植物、哺乳动物、病毒、昆虫、真菌或微生物的表型进行评估。
14.如权利要求13所述的方法，所述方法进一步包括：确定植物、哺乳动物、病毒、昆虫、真菌或微生物中所述预期基因编辑的存在或不存在。
15.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：将包含所述预期基因编辑的植物、哺乳动物、病毒、昆虫、真菌或微生物与另外的植物、哺乳动物、病毒、昆虫、真菌或微生物杂交。
16.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：在源自包含所述预期基因编辑的植物、哺乳动物、病毒、昆虫、真菌或微生物的子代植物、哺乳动物、病毒、昆虫、真菌或微生物中确定所述预期基因编辑的存在或不存在。
17.一种产生在群体中发现的单倍型的共有序列的方法，所述方法包括：
(a)对群体中不同基因型的两个或更多个个体的目的区域进行测序，以产生核苷酸序列读段；
(b)将所述核苷酸序列读段与一个或多个主题序列进行比对以鉴定核苷酸变异；
(c)使用所述目的区域中的所述核苷酸变异来定义一个或多个单倍型；
(d)将来自所述群体的至少一个个体分配至步骤(c)中的一个或多个单倍型；和
(e)产生单倍型共有序列，所述单倍型共有序列从来自步骤(d)中分配的一个或多个个体的区域的核苷酸序列读段组装。
18.一种产生在群体中发现的主题单倍型的共有序列的方法，所述方法包括：
(a)对群体中不同基因型的两个或更多个个体的目的区域进行测序，以产生核苷酸序列读段；
(b)将所述核苷酸序列读段与一个或多个主题序列进行比对以鉴定核苷酸变异；
(c)使用所述目的区域中的所述核苷酸变异来定义一个或多个单倍型；
(d)将来自所述群体的至少一个个体分配至步骤(c)中的单倍型；
(e)基于所述目的区域中的所述核苷酸变异，针对每个共同单倍型产生核苷酸变体频率的图谱，以产生共同单倍型图谱；
(f)鉴定所述主题单倍型中是否存在与所述共同单倍型...
【专利技术属性】
技术研发人员：A鲍姆加滕，JP格尔克，H郭，MG金，林海宁，RB米利，B彼得森伯奇，张芸，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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