一种新型小激活RNA制造技术

提供了一种小激活RNA及其在制备用于激活或上调靶基因表达的药物中的应用，所述小激活RNA由包含17至30个核苷酸的第一寡核苷酸链和包含17至30个核苷酸的第二寡核苷酸链组成，所述第一寡核苷酸链中至少有15个核苷酸长度的序列与所述第二寡核苷酸链形成碱基互补，所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链与靶基因启动子上任一长度为15‑30个核苷酸的连续片段存在75％以上的同源性或互补性，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成1‑4个核苷酸的突出端。

A novel small activated RNA

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种新型小激活RNA
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及利用靶向基因启动子序列的双链小RNA正向调控基因表达。
技术介绍
双链小核酸分子包括化学合成的寡核糖核苷酸如小激活RNA(saRNA)和天然存在的寡核糖核苷酸如微小核糖核苷酸(miRNA)已被证明能够以序列特异性的方式靶向蛋白编码基因的调控序列如启动子序列而在转录和表观遗传水平正向调控基因的表达水平，这种现象被称为RNA激活(RNAa)(Li，Okino et al.(2006)Proc Natl Acad Sci U S A 103：17337-17342；Janowski，Younger et al.(2007)Nat Chem Biol 3：166-173；Place，Li et al.(2008)Proc Natl Acad Sci U S A 105：1608-1613；Huang，Place et al.(2012)Nucleic Acids Res 40：1695-1707；Li(2017)Adv Exp Med Biol 983：1-20)。研究表明RNA激活是从秀丽隐杆线虫到人的进化保守的内源性分子机制(Huang，Qin et al.(2010)PLoS One 5：e8848；Seth，Shirayama et al.(2013)Dev Cell 27：656-663；Turner，Jiao et al.(2014)Cell Cycle 13：772-781)。如何安全且有选择性的增强人体细胞内源性基因或者蛋白质表达仍然是基因治疗领域的一个巨大挑战。传统的基于病毒基因治疗系统具有其固有的缺陷，包括有可能改变宿主基因组及引起免疫反应等副作用。而RNA激活具有能够激活内源基因表达而不改变基因组的优点，代表了一种激活内源性基因表达的新策略，在疾病治疗方面具有巨大的应用价值。p21WAF1/CIP1(也称CDKN1A，下称p21)基因为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，是一个重要的肿瘤抑制基因(Harper，Adami et al.(1993)Cell 75：805-816；Fang，Igarashi et al.(1999)Oncogene 18：2789-2797)。研究表明，异位载体过表达p21或者通过激活内源性p21的转录可以有效抑制肿瘤细胞和在体肿瘤的生长(Harper，Adami et al.(1993)Cell 75：805-816；Eastham，Hall et al.(1995)Cancer Res 55：5151-5155；Wu，Bellas et al.(1998)J Exp Med 187：1671-1679；Harrington，Spitzweg et al.(2001)J Urol 166：1220-1233)。因此，靶向激活p21基因的方法有可能在诸多疾病例如癌症的治疗上有广泛应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种能够在细胞内靶向增加基因表达的寡核苷酸分子和方法。该方法通过向细胞内引入靶向靶基因启动子序列的寡核苷酸分子，从而有效地增加目的基因的表达，并产生有效的生物学作用。本专利技术所述的寡核苷酸是在结构方面得到优化的双链核糖核苷酸分子，这种分子也被称为小激活RNA(saRNA)。本专利技术提供了一种小激活RNA，所述的小激活RNA由包含17至30个核苷酸的第一寡核苷酸链和包含17至30核苷酸的第二寡核苷酸链组成，所述第一寡核苷酸链中至少有15个核苷酸长度的序列与所述第二寡核苷酸链形成碱基互补，所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链与靶基因启动子上任一长度为15-30个核苷酸的连续片段存在75％以上例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、99％以上、100％的序列同源性或互补性，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端即无突出端结构，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成1-4个核苷酸的突出端，例如1、2、3、4个核苷酸的突出端。在一个具体实施例中，上述小激活RNA中的第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成2-3个核苷酸的突出端。上述的小激活RNA，其中突出端的核苷酸可以选自T(胸腺嘧啶)、U(尿嘧啶)或天然核苷酸突出，例如突出端为dTdTdT、dTdT、UUU、UU或连续的2个或3个天然核苷酸(例如A、T、G、C)。本专利技术中所述的天然核苷酸突出，是指第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的末端突出的核苷酸与对应的靶点序列的核苷酸相同或互补。上述的小激活RNA，其中第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的5’端处于双链体平端，所述第一或第二寡核苷酸链中自5’端起的第1至第3个核苷酸与另一条链对应位置的核苷酸存在1-3个碱基的错配。优选情况下错配为胞嘧啶错配。本文所述的胞嘧啶错配至少有两种方式，一种方式是一条链上的核苷酸本身为胞嘧啶核苷酸(C)，而在合成第二条链时将与胞嘧啶通过Watson-Crick配对的鸟嘌呤核苷酸(G)替换为非鸟嘌呤核苷酸如腺嘌呤核苷酸(A)或胸腺嘧啶核苷酸(T)或尿嘧啶核苷酸(U)；另一种方式是一条链上的核苷酸本身为非鸟嘌呤核苷酸如为腺嘌呤核苷酸(A)或尿嘧啶核苷酸(U)或胸腺嘧啶核苷酸(T)，而将另一条链上原本与A或U或T通过Watson-Crick配对的核苷酸替换为胞嘧啶核苷酸(C)。本专利技术提供的小激活RNA，其中第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体不包含突出端的长度为17-24个核苷酸，例如17、18、19、20、21、22、23、24；优选情况下，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体不包含突出端的长度为18-20个核苷酸。本专利技术还提供了上述小激活RNA在制备用于激活或上调靶基因在细胞中表达的制剂例如药物中的应用。所述的小激活RNA可以被直接导入所述细胞中。所述的细胞是哺乳动物细胞，优选为人类细胞。所述人类细胞可以存在于人体中，也可以是离体的如分离的细胞系或细胞株或原代细胞。上述所述的人体是患有由靶基因表达缺陷和/或不足引发的疾病病患，并且所述小激活核酸分子被施用以有效量以实现对疾病的治疗。在一种情况下，所述的小激活RNA的靶基因为人p21基因，在其他情况下也可以是因为基因表达缺陷或不足引起疾病的其他的致病基因，例如KLF4基因、NKX3-1基因、VEGFA基因。当靶基因为p21基因或其他基因时，所述的小激活RNA能够激活或上调靶基因表达为上调至少10％，例如10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上。本专利技术还提供了包含上述小激活RNA和药学上可接受的载体的组合物。其中药学上可接受的载体为脂质体、高分子聚合物或多肽。本专利技术还提供了上述小激活RNA或组合物在制备用于激活或上调靶基因表达的药物中的应用，优选为在制备抗肿瘤或良性增殖性病变的药物中的应用，更优选地，所述肿瘤为膀胱癌、前列腺癌、肝癌或结直肠癌。附图说明图1示出p21基因启动子序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小激活RNA，其中所述的小激活RNA由包含17至30个核苷酸的第一寡核苷酸链和包含17至30核苷酸的第二寡核苷酸链组成，所述第一寡核苷酸链中至少有15个核苷酸长度的序列与所述第二寡核苷酸链形成碱基互补，所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链与靶基因启动子上任一长度为15-30个核苷酸的连续片段存在75％以上的同源性或互补性，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成1-4个核苷酸的突出端。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180410 CN 201810317366X一种小激活RNA，其中所述的小激活RNA由包含17至30个核苷酸的第一寡核苷酸链和包含17至30核苷酸的第二寡核苷酸链组成，所述第一寡核苷酸链中至少有15个核苷酸长度的序列与所述第二寡核苷酸链形成碱基互补，所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链与靶基因启动子上任一长度为15-30个核苷酸的连续片段存在75％以上的同源性或互补性，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成1-4个核苷酸的突出端。


如权利要求1所述的小激活RNA，其中第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成2-3个核苷酸的突出端。


如权利要求1或2所述的小激活RNA，其中所述突出端的核苷酸选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或天然核苷酸。


如权利要求3所述的小激活RNA，其中突出端为dTdTdT、dTdT、UUU、UU或连续的2个或3个天然核苷酸。


如权利要求1至4中任一项所述的小激活RNA，其中所述第一或第二寡核苷酸链的5’端处于双链体平端，所述第一或第二寡核苷酸链中自5’端起的第1至第3个核苷酸与另一条链对应位置的核苷酸存在1-3个碱基的错配。


如权利要求5所述的小激活RNA，其中所述错配的碱基为胞嘧啶。


如权利要求1至6中任一项所述的小激活RNA，其中第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的不包含突出端的双链体长...

【专利技术属性】
技术研发人员：李龙承，姜武林，罗伯特·F·佩雷斯，吴建成，
申请(专利权)人：中美瑞康核酸技术南通研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32